本發(fā)明屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種溫度可控的電化學(xué)汞離子傳感器及其制備方法，應(yīng)用于核酸檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

重金屬離子hg²⁺等由于它們的性質(zhì)相對(duì)比較穩(wěn)定，在自然環(huán)境中很難被生物降解，且具有很強(qiáng)的生物毒性，會(huì)通過(guò)食物鏈的富集最終殘留在人體內(nèi)，并破壞人體的各種生理功能，最終對(duì)人體的組織器官甚至于生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，對(duì)汞離子建立快速、可靠的檢測(cè)方法的研究，在環(huán)境監(jiān)測(cè)與食品安全檢測(cè)等方面具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的重金屬離子檢測(cè)方法主要是依賴(lài)于大型的專(zhuān)業(yè)儀器，這些方法主要缺點(diǎn)是成本高且使用維護(hù)要求高等。因此相比之下，電化學(xué)分析技術(shù)是通過(guò)導(dǎo)線來(lái)感測(cè)待測(cè)物質(zhì)信號(hào)的，具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便易自動(dòng)化、便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)，且其兼?zhèn)潇`敏度和準(zhǔn)確度較高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，因此常用于金屬離子檢測(cè)。2004年ono小組首次提出“t-hg²⁺-t”結(jié)構(gòu)，即hg²⁺能夠與t-t錯(cuò)配堿基對(duì)特異性結(jié)合，形成“t-hg²⁺-t”穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。將t-t作為hg²⁺特異性識(shí)別基團(tuán)，從而可以構(gòu)建出多種的hg²⁺傳感分析方法。由于很低濃度的hg²⁺就會(huì)對(duì)人體的健康造成嚴(yán)重?fù)p害，因此高靈敏度和高準(zhǔn)確性一直是分析檢測(cè)方法的改進(jìn)目標(biāo)。針對(duì)這一需求，一種簡(jiǎn)單、快速的基于外切酶iii的信號(hào)放大方法被廣泛運(yùn)用于各種分子離子的高靈敏檢測(cè)。

外切酶ⅲ是一種對(duì)溫度變化十分敏感的生物大分子，溫度低于最適溫度時(shí)酶的活性較差，但過(guò)高的溫度極易使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變性導(dǎo)致酶失活。以往報(bào)道的電流型生物傳感器，大多控制實(shí)驗(yàn)體系的整體溫度變化，所需裝置復(fù)雜，操作不易；在熱電極表面構(gòu)建生物傳感器，可以只改變電極表面溫度使酶處于最適條件而不對(duì)溶液進(jìn)行整體加熱，又增強(qiáng)了溶液對(duì)流，提高了傳質(zhì)速率，可縮短傳感器到達(dá)穩(wěn)態(tài)電流的時(shí)間，并增大電極響應(yīng)信號(hào)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種溫度可控的電化學(xué)汞離子傳感器及其制備方法。本發(fā)明利用雙鏈dna序列中的特殊堿基對(duì)t-t錯(cuò)配能夠與hg²⁺特異性結(jié)合，再利用外切酶iii的切割作用釋放hg²⁺，實(shí)現(xiàn)對(duì)hg²⁺的高靈敏分析檢測(cè)；本發(fā)明的傳感器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、選擇性好，為環(huán)境監(jiān)測(cè)與食品安全等方面提供了一種快速、低成本檢測(cè)hg²⁺的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一組用于溫度可控的電化學(xué)汞離子傳感器的信號(hào)探針，信號(hào)探針p1與輔助探針p2互補(bǔ)存在可以識(shí)別hg²⁺的t-t錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，其核苷酸序列如下：

信號(hào)探針p1：5’-sh-(ch2)6-ccccat(fc)cgccaccagcttct-3’，

輔助探針p2：5’-tgtagctggtggcgatcccac-3’；

其中，信號(hào)探針p1的近5’標(biāo)記了二茂鐵（fc）且其5’端有巰基化修飾。

一種溫度可控的電化學(xué)汞離子傳感器，該傳感器是基于外切酶iii目標(biāo)循環(huán)信號(hào)放大的電化學(xué)hg²⁺傳感器，其組成成分包括金盤(pán)熱電極、信號(hào)探針p1、輔助探針p2和核酸外切酶iii。

其制備方法包括以下步驟：

（1）設(shè)計(jì)并合成信號(hào)探針p1和輔助探針p2；

（2）將金盤(pán)熱電極打磨拋光成鏡面，經(jīng)二次蒸餾水超聲清洗，干燥，得處理后的金盤(pán)熱電極；

（3）將含有信號(hào)探針p1的緩沖溶液滴加在步驟（2）中處理好的金盤(pán)熱電極上，再用巰基己醇對(duì)電極表面殘余位點(diǎn)進(jìn)行封閉，得到信號(hào)探針p1修飾的金盤(pán)熱電極；

（4）將步驟（3）中得到的電極浸泡在含有輔助探針p2、外切酶iii和不同濃度hg²⁺混合緩沖液溶液中進(jìn)行雜交酶切循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后得到電化學(xué)hg²⁺傳感器。

其中，所述步驟（2）中，打磨采用在麂皮上用氧化鋁粉末打磨；超聲清洗的時(shí)間為20～60s，干燥方式為氮?dú)獯蹈伞?/p>

步驟（3）中，所述緩沖液為含有10～20mmtris-hcl，90～110mmnacl,9～11mm三（2-羧乙基）膦的混合液，其ph為7.2～7.6。

步驟（3）中，p1的濃度為1～2μm；修飾溫度為20～25℃；修飾時(shí)間為1.5～2.5h；巰基己醇濃度為0.1～4mm。

步驟（4）中，所述緩沖液為含有10～20mmtris-hcl，400～600mmnacl，9～11mmmgcl2的混合液，其ph為7.2～7.6。

步驟（4）中，p2的濃度為1～2μm，外切酶iii濃度為1～5μ/μl，雜交酶切循環(huán)反應(yīng)溫度為0～40℃，反應(yīng)時(shí)間為0.25～2h。

步驟（4）中，通過(guò)外加直流電流調(diào)控金盤(pán)熱電極溫度，來(lái)控制雜交酶切循環(huán)反應(yīng)過(guò)程溫度。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述溫度可控的電化學(xué)傳感器在檢測(cè)hg²⁺中的應(yīng)用，檢測(cè)步驟如下：

（1）將步驟（3）中得到的信號(hào)探針修飾的金盤(pán)熱電極在10mmtris-hcl檢測(cè)液與銀氯化銀參與電極和鉑絲對(duì)比電極構(gòu)成三電極系統(tǒng)，運(yùn)用方波伏安法（swv）進(jìn)行檢測(cè)，得到二茂鐵的氧化電流i0(fc)；

（2）將權(quán)利要求1所述步驟（4）中最終得到的電化學(xué)生物傳感器用swv在10mmtris-hcl檢測(cè)液中檢測(cè)，得到二茂鐵的氧化電流（ifc），然后與步驟（1）得到的i0(fc)做差取絕對(duì)值得：|δifc|=|ifc-i0(fc)|；以|δifc|對(duì)hg²⁺濃度對(duì)數(shù)做線性回歸方程，得工作曲線。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下有益效果：

（1）本發(fā)明在設(shè)計(jì)單鏈信號(hào)探針過(guò)程中，將二茂鐵標(biāo)記在靠近巰基化5’的位置，拉近二茂鐵與電極表面的距離，大大提高了電極表面二茂鐵的電化學(xué)信號(hào)，同時(shí)代替了復(fù)雜的發(fā)卡結(jié)構(gòu)信標(biāo)分子；

（2）本發(fā)明利用hg²⁺能夠與t-t錯(cuò)配堿基對(duì)特異性結(jié)合，形成“t-hg²⁺-t”穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，提高了電化學(xué)hg²⁺傳感器的選擇性及其在實(shí)際樣品中的實(shí)用性。

（3）本發(fā)明將外切酶iii目標(biāo)循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)應(yīng)用到hg²⁺的檢測(cè)中來(lái)，在實(shí)現(xiàn)高靈敏地對(duì)hg²⁺進(jìn)行檢測(cè)（檢測(cè)限達(dá)到6.1pm）的同時(shí)還具有操作簡(jiǎn)便，低成本，檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)。

（4）本發(fā)明在金盤(pán)熱電極表面構(gòu)建生物傳感器，可以只改變電極表面溫度使外切酶iii處于最適條件而不對(duì)溶液進(jìn)行整體加熱，增強(qiáng)了溶液對(duì)流，提高了傳質(zhì)速率，增強(qiáng)了外切酶iii活性，促進(jìn)了酶切反應(yīng)的進(jìn)行，并增大電極響應(yīng)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明一種溫度可控的電化學(xué)hg²⁺傳感器的制備過(guò)程示意圖。

圖2實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件圖，雜交酶切循環(huán)過(guò)程反應(yīng)時(shí)間。

圖3實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件圖，雜交酶切循環(huán)過(guò)程電極溫度。

圖4本發(fā)明電化學(xué)hg²⁺傳感器對(duì)不同濃度的hg²⁺的電化學(xué)響應(yīng)。

圖5本發(fā)明電化學(xué)hg²⁺傳感器對(duì)其他不同金屬離子的電化學(xué)響應(yīng)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，以便更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

一種溫度可控的基于外切酶iii目標(biāo)循環(huán)信號(hào)放大的電化學(xué)hg²⁺傳感器的制備方法，如圖1所示，包括以下步驟：

（1）設(shè)計(jì)一條靠近5’標(biāo)記了二茂鐵（fc）的信號(hào)探針p1，所述信號(hào)探針p1與dna輔助探針p2的互補(bǔ)存在可以識(shí)別hg²⁺的t-t錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，在hg²⁺存在下，p2與p1進(jìn)行雜交，形成帶有t-hg²⁺-t結(jié)構(gòu)的具有3’平端的雙鏈結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)核酸外切酶iii對(duì)p1進(jìn)行消解，hg²⁺被釋放循環(huán)利用；p1鏈的5’端巰基化；

其中，信號(hào)探針p1的核苷酸序列為：5’-sh-(ch2)6-ccccat(fc)cgccaccagcttct-3’，

輔助探針p2的核苷酸序列為：5’-tgtagctggtggcgatcccac-3’；

（2）金盤(pán)熱電極在麂皮上用0.05mmal2o3打磨成鏡面，用二次蒸餾水超聲清洗40～60s；之后再0.5m硫酸溶液中循環(huán)伏安，掃速0.1v/s至穩(wěn)定后二次水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈桑?/p>

（3）將信號(hào)探針p1溶于ph為7.4的含有10mmtris-hcl，100mmnacl，10mm三（2-羧乙基）膦的緩沖液中使其終濃度為1mm，處理2小時(shí)打開(kāi)二硫鍵；后將3ml其溶液滴加在步驟（2）中處理好的金盤(pán)熱電極上，在25℃下修飾時(shí)間2h；再用濃度為2mm巰基己醇對(duì)電極表面殘余位點(diǎn)進(jìn)行封閉，封閉時(shí)間為1h，得到信號(hào)探針p1修飾的金盤(pán)熱電極；

（4）將2mmp2、2μ/μl外切酶iii和一定濃度hg²⁺的混合在ph為7.4的含有10mmtris-hcl，500mmnacl，10mmmgcl2的緩沖液中，將步驟（2）中得到的電極浸泡在此緩沖液中進(jìn)行雜交酶切循環(huán)，在40℃下反應(yīng)1h，反應(yīng)溫度是通過(guò)外加直流電流調(diào)控金盤(pán)熱電極溫度來(lái)控制，反應(yīng)結(jié)束后得到電化學(xué)hg²⁺傳感器。

實(shí)施例2

反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：

變實(shí)施例1步驟（4）中的酶切循環(huán)反應(yīng)時(shí)間依次為0,15,30,45,60,75,90,105,120min.分別在不同電極溫度(0oc，25oc，40oc)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他反應(yīng)條件同實(shí)施例1；將實(shí)施例1步驟（3）中得到的巰基化信號(hào)探針p1修飾的金盤(pán)熱電極在10mmtris-hcl檢測(cè)液中進(jìn)行swv檢測(cè)，得到fc的氧化峰電流i0(fc)；將實(shí)施例1步驟（4）中最終得到的電化學(xué)生物傳感器用swv在10mmtris-hcl檢測(cè)液中檢測(cè)，將得到的fc的氧化峰電流ifc與得到的i0(fc)做差取絕對(duì)值得：|δifc|=|ifc-i0(fc)|；以|δifc|對(duì)溫度作圖，如圖2所示，在同一電極溫度下可以看出隨反應(yīng)時(shí)間的持續(xù)|δifc|變大，最終達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值。而在不同的酶切循環(huán)反應(yīng)溫度下，溫度越高所達(dá)到的平衡程度更完全更徹底，這些結(jié)果也初步說(shuō)明了溫度升高提高了exoiii的活性，并促進(jìn)酶切循環(huán)的進(jìn)行，縮短反應(yīng)時(shí)間。從實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的高效性和靈敏度考慮，選擇酶切循環(huán)反應(yīng)時(shí)間為60min作為檢測(cè)hg²⁺的反應(yīng)時(shí)間。

實(shí)施例3

反應(yīng)溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：

只改變實(shí)施例1步驟（4）中的反應(yīng)溫度，其中a為對(duì)照組，b-f的反應(yīng)溫度依次為0,10,20,24,30,35,40oc，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他反應(yīng)條件同時(shí)實(shí)施例1；將實(shí)施例1步驟（3）中得到的信號(hào)探針p1修飾的金盤(pán)熱電極在10mmtris-hcl檢測(cè)液中進(jìn)行swv檢測(cè)，得到fc的氧化峰電流i0(fc)；將實(shí)施例1步驟（4）中最終得到的電化學(xué)生物傳感器用swv在10mmtris-hcl檢測(cè)液中檢測(cè)，將得到的fc的氧化峰電流與得到的i0(fc)做差取絕對(duì)值得：|δifc|=|ifc-i0(fc)|；以|δifc|對(duì)溫度作圖，如圖3所示，可以看出隨溫度升高|δifc|變大，說(shuō)明溫度升高可以增加exoiii的活性，促使酶切反應(yīng)更快的進(jìn)行。最終選用40oc為最佳酶切循環(huán)反應(yīng)溫度。

實(shí)施例4

為本發(fā)明電化學(xué)hg²⁺傳感器對(duì)hg²⁺的電化學(xué)靈敏度檢測(cè)：

采用本發(fā)明所述的電化學(xué)hg²⁺傳感器，標(biāo)記了二茂鐵的信號(hào)探針p1（序列：5’-sh-(ch2)6-ccccat(fc)cgccaccagcttct-3’）作為信號(hào)探針，以與p1存在可以識(shí)別hg²⁺的t-t錯(cuò)配的p2（序列：5’-tgtagctggtggcgatcccac-3’）作為輔助探針。所有操作步驟均如同上述實(shí)施例1，其中，通過(guò)改變hg²⁺的濃度，檢測(cè)本發(fā)明電化學(xué)hg²⁺傳感器的電化學(xué)響應(yīng)特性。

其檢測(cè)過(guò)程為：將實(shí)施例1步驟（3）中得到的信號(hào)探針p1修飾的金盤(pán)熱電極在10mmtris-hcl檢測(cè)液進(jìn)行swv檢測(cè)，得到二茂鐵的氧化電流i0(fc)；將實(shí)施例1步驟（4）中最終得到的電化學(xué)生物傳感器用swv在10mmtris-hcl檢測(cè)液中檢測(cè)，將得到的二茂鐵的氧化電流與得到的i0(fc)做差取絕對(duì)值得：|δifc|=|ifc-i0(fc)|；以|δifc|對(duì)tp濃度對(duì)數(shù)做線性回歸方程，得工作曲線。

其檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，在雜交酶切循環(huán)過(guò)程在0℃下進(jìn)行時(shí)，所檢測(cè)的hg²⁺濃度從a到f依次為0m,5nm,10nm,20nm,50nm,100nm，|δifc|與hg²⁺濃度在5.0nm～100.0nm呈線性，檢測(cè)限為0.7nm(s/n=3)；在雜交酶切循環(huán)過(guò)程在25℃下進(jìn)行時(shí)，所檢測(cè)的hg²⁺濃度從a到g依次為0m,100pm,500pm,1nm,5nm,10nm,100nm，|δifc|與hg²⁺濃度在100.0pm～100.0nm呈線性，檢測(cè)限為22.0pm(s/n=3)；當(dāng)在雜交酶切循環(huán)過(guò)程在40℃下進(jìn)行時(shí)，所檢測(cè)的hg²⁺濃度從a到i依次為0m,10pm,50pm,100pm,500pm,1nm,10nm,100nm，|δifc|與hg²⁺濃度在10.0pm～100.0nm范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為6.1pm(s/n=3)，相比于0℃時(shí)，其檢測(cè)限降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)，相比于25℃時(shí)，其檢測(cè)限降低了1個(gè)數(shù)量級(jí)，表明升高溫度，酶切活性性增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)hg²⁺高靈敏的檢測(cè)。

實(shí)施例5

為本發(fā)明電化學(xué)hg²⁺傳感器對(duì)其他不同金屬離子電化學(xué)響應(yīng)：

采用本發(fā)明所述方法，選取了其他多種常見(jiàn)的金屬離子如：ag⁺、cd³⁺、pb²⁺、co²⁺、cu²⁺、fe³⁺、ni²⁺、zn²⁺、mg²⁺進(jìn)行了選擇性實(shí)驗(yàn)。用于實(shí)驗(yàn)的hg²⁺濃度為100nm,其他離子均為10μm。每種離子在參與酶切循環(huán)反應(yīng)的條件都是在電極溫度為40oc下反應(yīng)1h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，分別在其他離子存在條件下制備的傳感器的swv峰電流im較實(shí)施例1步驟（3）中得到的i0(fc)沒(méi)有明顯變化；而在hg²⁺存在條件下制備的傳感器的swv曲線ihg2+較實(shí)施例1步驟（3）中得到的i0(fc)明顯下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基于t-hg²⁺-t的特異性結(jié)合作用，本試驗(yàn)方法對(duì)hg²⁺的檢測(cè)相對(duì)于其他金屬離子有很好的選擇性。

實(shí)施例6

為本發(fā)明電化學(xué)hg²⁺傳感器水樣加標(biāo)回收率檢測(cè)：

采用本發(fā)明所述方法，運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在自來(lái)水樣中加入3種不同濃度的hg²⁺標(biāo)液，酶切循環(huán)反應(yīng)在電極溫度為40oc下反應(yīng)1h實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)水樣進(jìn)行了回收率測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，回收率范圍為99.0~100.8%，說(shuō)明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的hg²⁺傳感器能夠準(zhǔn)確檢測(cè)水樣的hg²⁺含量。

表1不同濃度的水樣加標(biāo)回收率表

sequencelisting

<110>福州大學(xué)

<120>溫度可控的電化學(xué)汞離子傳感器及其制備方法

<130>2

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>信號(hào)探針p1

<400>1

ccccatcgccaccagcttct20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>輔助探針p2

<400>2

tgtagctggtggcgatcccac21