本發(fā)明涉及的是一種分子印跡傳感器的制備方法及快速檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種納米銅/石墨烯修飾電極人參皂苷rg1分子印跡傳感器的制備方法，用于檢測(cè)藥品、食品、生物樣品中的人參皂苷rg1。

背景技術(shù)：

人參皂苷（ginsenoside）是一種固醇類化合物，三萜皂苷。主要存在于人參屬藥材中。人參皂苷被視為是人參中的活性成分，因而成為研究的目標(biāo)。因?yàn)槿藚⒃碥沼绊懥硕嘀氐拇x通路，所以其效能也是復(fù)雜的，而且各種人參皂苷的單體成分是難以分離和檢測(cè)出來(lái)。人參中含有多種活性成分，人參皂苷是人參中主要活性成分，人參皂苷單體現(xiàn)已被分離鑒定出46種，其中re和rg1同屬于三醇類皂苷。人參皂苷re具有抗心律失常和保肝的作用，rg1表現(xiàn)為促中樞神經(jīng)興奮、益智，促進(jìn)蛋白質(zhì)、dna和rna的合成及具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效。re的主要分離方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、大孔吸附樹(shù)脂法等，但對(duì)其相似物rg1的分離存在分離難度大的弊端。分子結(jié)構(gòu)相近難以分離和檢測(cè)。

人參皂苷rg1，其分子式為c42h72o14，相對(duì)分子質(zhì)量為801.01，結(jié)晶性粉末，溶于甲醇、吡啶、熱丙酮，稍溶于乙酸乙酯及氯仿?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為人參對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)有廣泛的作用，從而可提高人體力、智力的活動(dòng)能力，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)有害刺激的非特異性抵抗力。人參的藥理活性常因機(jī)體機(jī)能狀態(tài)不同雙向作用，因此人參是具有“適應(yīng)原”樣作用的典型代表藥。人參皂苷rg1具有促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生、提高神經(jīng)可塑性、增強(qiáng)學(xué)習(xí)、記憶力、抗衰老、抗疲勞、提高免疫力、輔助抗腫瘤、修復(fù)性功能等作用，在高端保健、輔助抗腫瘤、防治老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病方面具有廣闊的應(yīng)用前景

目前，檢測(cè)人參皂苷rg1的方法主要有高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜，色譜法的準(zhǔn)確度受到一定限制、而且儀器比較貴需要專業(yè)人員操作，也限制了其應(yīng)用。另外，由于人參皂苷rg1與其它黃酮類分子結(jié)構(gòu)十分相近很難分開(kāi)，測(cè)定時(shí)互相干擾，準(zhǔn)確檢測(cè)人參皂苷rg1很困難。因此，找到一種選擇性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便用于的檢測(cè)人參皂苷rg1的方法具有重要使用價(jià)值。

分子印跡技術(shù)是當(dāng)前開(kāi)發(fā)具有分子識(shí)別功能的高選擇性材料的主要方法之一，它是通過(guò)在模板分子周圍形成一個(gè)高度交聯(lián)的剛性高分子，除去模板分子后在分子印跡聚合物的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中留下具有結(jié)合能力的識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)模板分子表現(xiàn)出高選擇識(shí)別性能的一種技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)以其構(gòu)效預(yù)定性和特異識(shí)別性越來(lái)越受到人們的關(guān)注，已經(jīng)成功用于固相萃取或微固相萃取，親和色譜或毛細(xì)管電泳及傳感器等領(lǐng)域。

依據(jù)此技術(shù)制備的分子印跡傳感器，應(yīng)用于藥物分析、環(huán)境保護(hù)及生命科學(xué)研究中起著十分重要的作用。將功能分子以適當(dāng)方式修飾到電極上，制備選擇性好、靈敏度高、有一定使用壽命可再生的電化學(xué)傳感器成為分析科學(xué)工作者努力探索的課題。但是傳統(tǒng)的印跡方法所制備的印跡膜厚度難以控制，高交聯(lián)度使得電子傳遞速度和響應(yīng)慢、檢測(cè)下限高，影響分子印跡技術(shù)在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用。因此，建立一種靈敏、快速、簡(jiǎn)便、特異性高、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì)使用的檢測(cè)方法，對(duì)食品、藥品、生物樣品中的rg1含量準(zhǔn)確定量測(cè)定十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是將分子印跡與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，提供了一種納米銅/石墨烯修飾電極人參皂苷rg1分子印跡傳感器的制備方法，主要是以人參皂苷rg1為模板，在玻碳電極表面通過(guò)氧化石墨烯、納米銅粒子的修飾，提高了傳感器的靈敏度，采用滴涂法制制備人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器。

儀器與試劑

chi660b電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），實(shí)驗(yàn)采用三電極體系：鉑絲電極為輔助電極，ag/agcl為參比電極（sce），玻碳電極（gce）為工作電極；kq-250e型超聲波清洗器（坤峰超聲儀器有限公司）。

氧化石墨烯；二乙烯苯乙二醇二甲基丙烯酸、衣康酸；1-烯丙基-3-乙基咪唑溴鹽，偶氮二異丁腈，甲醇，乙醇；人參皂苷rg1；醋酸銅；聚乙烯醇；抗壞血酸，磷酸緩沖溶液；所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種納米銅/石墨烯修飾電極人參皂苷rg1分子印跡傳感器的制備方法，特征在于，該方法具有以下工藝步驟：

（1）納米銅/石墨烯修飾液制備：在反應(yīng)器中，按如下組成質(zhì)量百分濃度加入，去離子水：80~86%，醋酸銅：2.0~5.0%，氧化石墨烯：6~12%，室溫下超聲20min，分散均勻，再加入抗壞血酸：3~8%，各組分含量之和為百分之百，加熱至60±2℃，攪拌反應(yīng)60min，得到納米銅/石墨烯修飾液；

（2）納米銅/石墨烯修飾電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后分別用二次蒸餾水超聲清洗，乙醇洗滌，吹干，在玻碳電極表面滴加20~25μl納米銅/石墨烯修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得納米銅/石墨烯修飾電極制備；

（3）人參皂苷rg1分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，按如下組成質(zhì)量百分濃度加入，甲醇：62~70%，二乙烯苯乙二醇二甲基丙烯酸：6~12%，衣康酸：4~8%，1-烯丙基-3-乙基咪唑溴鹽：7~16%，偶氮二異丁腈：1.0~3.0%，人參皂苷rg1：8~12%，各組分含量之和為百分之百，攪拌溶解，通惰性氣體除氧15min，無(wú)氧氛圍，60±2℃攪拌反應(yīng)24~28h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為8:1混合溶液浸泡12~15h，除去模板分子，干燥，即得人參皂苷rg1分子印跡聚合物；

（4）人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器的制備方法：取適量的人參皂苷rg1分子印跡聚合物分散于1%的明膠溶液中，制得20g/l的人參皂苷rg1分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液12~15μl滴加到步驟（2）制備的納米銅/石墨烯修飾電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器。

在步驟（1）中所述的醋酸銅與氧化石墨烯的質(zhì)量比為1：3最優(yōu)。

在步驟（3）中所述的二乙烯苯乙二醇二甲基丙烯酸：衣康酸：1-烯丙基-3-乙基咪唑溴鹽的摩爾為1：1：1最優(yōu)。

在步驟（3）中所述的惰性氣體為氖氣或氬氣。

在步驟（3）中所述的無(wú)氧氛圍為聚合反應(yīng)過(guò)程一直通入惰性氣體。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果是：

本發(fā)明將印跡技術(shù)、層層自組裝法和滴涂法相結(jié)合，在納米銀/碳納米管修飾玻碳電極表面成功地研制了一種具有特異選擇性的人參皂苷rg1印跡電化學(xué)傳感器。通過(guò)與納米銀/碳納米管修飾的分子印跡電極那個(gè)的響應(yīng)進(jìn)行比較，本發(fā)明制備的人參皂苷rg1分子印跡傳感器的響應(yīng)大大提高。該印跡傳感器對(duì)人參皂苷rg1表現(xiàn)出較高的親和性和選擇性，響應(yīng)電流與人參皂苷rg1的濃度在1.0×10^-7~1.0×10^-4mol/l范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為1.46×10^-8mol/l將本發(fā)明制備的人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器成功用于藥品、食品、生物樣品中人參皂苷rg1的檢測(cè)中，回收率在95.62~104.32%之間，因此本發(fā)明制備的人參皂苷rg1分子印跡傳感器可廣泛應(yīng)用于化工、生物醫(yī)藥、食品、環(huán)保檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

（1）納米銅/石墨烯修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：83ml，醋酸銅：4g，氧化石墨烯：8g，室溫下超聲20min，分散均勻，再加入抗壞血酸：5g，加熱至60±2℃，攪拌反應(yīng)60min，得到納米銅/石墨烯修飾液；

（2）納米銅/石墨烯修飾電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后分別用二次蒸餾水超聲清洗，乙醇洗滌，吹干，在玻碳電極表面滴加22μl納米銅/石墨烯修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得納米銅/石墨烯修飾電極制備；

（3）人參皂苷rg1分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，甲醇：84ml，二乙烯苯乙二醇二甲基丙烯酸：8g，衣康酸：6g，1-烯丙基-3-乙基咪唑溴鹽：10g，偶氮二異丁腈：1.0g，人參皂苷rg1：8g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧15min，無(wú)氧氛圍，60±2℃攪拌反應(yīng)26h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為8:1混合溶液浸泡13h，除去模板分子，干燥，即得人參皂苷rg1分子印跡聚合物；

（4）人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器的制備方法：取適量的人參皂苷rg1分子印跡聚合物分散于1%的明膠溶液中，制得20g/l的人參皂苷rg1分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液13μl滴加到步驟（2）制備的納米銅/石墨烯修飾電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器。

實(shí)施例2

（1）納米銅/石墨烯修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：86ml，醋酸銅：2g，氧化石墨烯：6g，室溫下超聲20min，分散均勻，再加入抗壞血酸：6g，加熱至60±2℃，攪拌反應(yīng)60min，得到納米銅/石墨烯修飾液；

（2）納米銅/石墨烯修飾電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后分別用二次蒸餾水超聲清洗，乙醇洗滌，吹干，在玻碳電極表面滴加23μl納米銅/石墨烯修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得納米銅/石墨烯修飾電極制備；

（3）人參皂苷rg1分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，甲醇：78ml，二乙烯苯乙二醇二甲基丙烯酸：10g，衣康酸：5g，1-烯丙基-3-乙基咪唑溴鹽：8g，偶氮二異丁腈：3.0g，人參皂苷rg1：12g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧15min，無(wú)氧氛圍，60±2℃攪拌反應(yīng)24h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為8:1混合溶液浸泡14h，除去模板分子，干燥，即得人參皂苷rg1分子印跡聚合物；

（4）人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器的制備方法：取適量的人參皂苷rg1分子印跡聚合物分散于1%的明膠溶液中，制得20g/l的人參皂苷rg1分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液14μl滴加到步驟（2）制備的納米銅/石墨烯修飾電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器。

實(shí)施例3

（1）納米銅/石墨烯修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：80ml，醋酸銅：5g，氧化石墨烯：12g，室溫下超聲20min，分散均勻，再加入抗壞血酸：3g，加熱至60±2℃，攪拌反應(yīng)60min，得到納米銅/石墨烯修飾液；

（2）納米銅/石墨烯修飾電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后分別用二次蒸餾水超聲清洗，乙醇洗滌，吹干，在玻碳電極表面滴加20μl納米銅/石墨烯修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得納米銅/石墨烯修飾電極制備；

（3）人參皂苷rg1分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，甲醇：88ml，二乙烯苯乙二醇二甲基丙烯酸：6g，衣康酸：4g，1-烯丙基-3-乙基咪唑溴鹽：9g，偶氮二異丁腈：1.0g，人參皂苷rg1：10g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧15min，無(wú)氧氛圍，60±2℃攪拌反應(yīng)28h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為8:1混合溶液浸泡12h，除去模板分子，干燥，即得人參皂苷rg1分子印跡聚合物；

（4）人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器的制備方法：取適量的人參皂苷rg1分子印跡聚合物分散于1%的明膠溶液中，制得20g/l的人參皂苷rg1分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液12μl滴加到步驟（2）制備的納米銅/石墨烯修飾電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器。

實(shí)施例4

（1）納米銅/石墨烯修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：82ml，醋酸銅：3g，氧化石墨烯：10g，室溫下超聲20min，分散均勻，再加入抗壞血酸：5g，加熱至60±2℃，攪拌反應(yīng)60min，得到納米銅/石墨烯修飾液；

（2）納米銅/石墨烯修飾電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后分別用二次蒸餾水超聲清洗，乙醇洗滌，吹干，在玻碳電極表面滴加25μl納米銅/石墨烯修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得納米銅/石墨烯修飾電極制備；

（3）人參皂苷rg1分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，甲醇：81ml，二乙烯苯乙二醇二甲基丙烯酸：12g，衣康酸：8g，1-烯丙基-3-乙基咪唑溴鹽：8g，偶氮二異丁腈：1.0g，人參皂苷rg1：7g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧15min，無(wú)氧氛圍，60±2℃攪拌反應(yīng)25h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為8:1混合溶液浸泡15h，除去模板分子，干燥，即得人參皂苷rg1分子印跡聚合物；

（4）人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器的制備方法：取適量的人參皂苷rg1分子印跡聚合物分散于1%的明膠溶液中，制得20g/l的人參皂苷rg1分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液15μl滴加到步驟（2）制備的納米銅/石墨烯修飾電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器。

實(shí)施例5

將上述實(shí)施例1~4所制備的人參皂苷rg1分子印跡電化學(xué)傳感器，用于人參皂苷rg1的檢測(cè)，步驟如下：

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的人參皂苷rg1標(biāo)準(zhǔn)溶液，底液為ph7.0的磷酸鹽緩沖溶液；

（2）工作曲線繪制：將ag/agcl為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，本發(fā)明制備的電極為工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接chi660b電化學(xué)工作站，在k3[fe(cn)6]溶液中，采用循環(huán)伏安法在-0.20~1.0v電位范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流記為i0，含有不同濃度的人參皂苷rg1標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)電流即為ii，響應(yīng)電流降低的差值為△i=i0-ii，△i與人參皂苷rg1標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度c之間呈線性關(guān)系，繪制△i~c工作曲線；

（3）人參皂苷rg1的檢測(cè)：用待測(cè)樣品代替步驟（1）中的人參皂苷rg1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟（2）的方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)響應(yīng)電流降低的差值△i和工作曲線，得到待測(cè)樣品中人參皂苷rg1的含量；

所述k3[fe(cn)6]溶液的濃度為1.0mmol/l；

所述ph7.0的磷酸鹽緩沖溶液的濃度在40mmol/l。