一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種功能化的sers造影劑及其制備方法和用途，屬于表面增強拉曼散射造影劑領(lǐng)域。

二、

背景技術(shù)：

表面增強拉曼散射(sers)技術(shù)可以提供目標物的指紋光譜信息，靈敏度高、光譜峰窄且不受水的干擾，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的放射性造影劑以及熒光造影劑相比，sers造影劑可以有效地避免放射性材料的潛在危害以及樣品自身熒光的干擾和光漂白效應(yīng)等。典型的sers造影劑是以貴金屬納米粒子為增強基底、拉曼活性物質(zhì)為示蹤劑、靶向配體為識別單元的納米生物探針。目前，主要的制備方式有三種：(1)將拉曼活性物質(zhì)和靶向配體直接修飾到貴金屬納米粒子表面；(2)用氧化硅或聚合物包被拉曼活性分子標記的納米粒子并將靶向配體固定于殼層結(jié)構(gòu)上；(3)將拉曼活性分子與靶向配體共價結(jié)合，進而以單層組裝的方式修飾到納米粒子表面。由于拉曼標記分子和配體的數(shù)量都達到了最大化，第三種制備方式能明顯地提高sers造影劑對目標物的結(jié)合能力并放大檢測信號。然而，這種sers造影劑并沒有取代傳統(tǒng)的造影劑而廣泛應(yīng)用于細胞、組織以及活體腫瘤的靶向成像及治療中，其中的一個主要原因是缺乏一種通用的合成策略來制備這種高選擇性和高靈敏性的sers造影劑。

點擊化學(xué)是一種合成碳雜原子化合物的新方法，該方法的主要特點是原料易得、操作簡單、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、無副產(chǎn)物。通過點擊化學(xué)合成策略可將具有拉曼活性的疊氮或炔基化合物與配體偶聯(lián)的炔基或疊氮化合物進行共價連接，進而發(fā)展出一系列的功能化sers造影劑。目前，這種基于點擊化學(xué)功能化的sers造影劑及其應(yīng)用還未見報道。

三、

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種功能化的sers造影劑及其制備方法和用途，所要解決的技術(shù)問題是設(shè)計遴選一種通用的合成策略來制備高選擇性和高靈敏性的sers造影劑。本發(fā)明的制備方法反應(yīng)條件溫和，標記效率高，并在腫瘤細胞診斷的過程中作為造影劑使用。

本發(fā)明功能化的sers造影劑，其結(jié)構(gòu)通式為下式ⅰ或式ⅱ：

其中表示貴金屬納米粒子，為金納米粒子或銀納米粒子等具有顯著拉曼增強效應(yīng)的納米粒子，粒徑為30-100nm；

r表示具有拉曼活性的結(jié)構(gòu)單元，為5-巰基-2-硝基苯甲酸衍生物，其結(jié)構(gòu)通式為：

其中n＝2-10。

l表示靶向配體，為通過酰胺化反應(yīng)得到的葉酸衍生物，具體結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明功能化的sers造影劑的制備方法，是將含有疊氮官能團的拉曼活性物質(zhì)共價結(jié)合在貴金屬納米粒子表面，并與含有炔基官能團的靶向配體發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)得到目標產(chǎn)物。

所述含有疊氮官能團的拉曼活性物質(zhì)是通過5-巰基-2-硝基苯甲酸的羧基官能團與氨基聚乙二醇疊氮的氨基官能團耦合反應(yīng)得到的，其結(jié)構(gòu)通式為：

其中n＝2-10。

所述含有炔基官能團的靶向配體是通過雙環(huán)[6.1.0]壬炔胺的氨基官能團，或丙炔胺的氨基官能團與葉酸的羧基官能團耦合反應(yīng)得到的，其具體結(jié)構(gòu)式為：

所述點擊化學(xué)反應(yīng)為疊氮官能團和炔基官能團發(fā)生的1,3偶極環(huán)加成反應(yīng)。

本發(fā)明功能化的sers造影劑的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：將40μl濃度為0.03m的含有疊氮官能團的拉曼活性物質(zhì)加入到1ml濃度為5.0×10^-10-1.0×10^-8m的貴金屬納米粒子溶液中，室溫條件下攪拌3小時，離心、洗滌后得到拉曼活性物質(zhì)標記的納米粒子；

步驟2：將60μl0.02m含有炔基官能團的靶向配體加入到步驟1得到的拉曼活性物質(zhì)標記的納米粒子中，室溫下通過1,3偶極環(huán)加成反應(yīng)得到功能化的sers造影劑。

步驟2的1,3偶極環(huán)加成反應(yīng)可以在催化劑存在的條件下進行，也可以在無催化劑的條件下進行，是否需要添加催化劑與含有炔基官能團的靶向配體中所含炔基的類型有關(guān)：若為含八元環(huán)結(jié)構(gòu)的炔基化合物，例如實施例1，就無需催化劑，反應(yīng)時間為0.5-1小時；若為其它炔基化合物，例如實施例2，就需要添加催化劑，反應(yīng)時間為6-24小時。

所述催化劑為一價銅離子，由50μl0.1m硫酸銅溶液和50μl0.2m抗壞血酸溶液反應(yīng)得到。

本發(fā)明功能化的sers造影劑的用途，是在腫瘤細胞的靶向成像診斷中作為造影劑的應(yīng)用。

所述腫瘤細胞為人口腔表皮癌細胞、宮頸癌細胞、卵巢癌細胞、乳腺癌細胞或肺癌細胞等膜表面表達葉酸受體的腫瘤細胞。

本發(fā)明功能化的sers造影劑的應(yīng)用，是在腫瘤細胞的靶向成像診斷中作為造影劑的應(yīng)用，過程如下：將10-200μl5.0×10^-10-1.0×10^-8m功能化的sers造影劑加入到2ml含有腫瘤細胞的培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2條件下共培養(yǎng)0.5-12h，洗滌后加入ph值7.0的pbs溶液并進行sers成像。

本發(fā)明通過點擊化學(xué)的策略來合成功能化的sers造影劑，并利用靶向配體與腫瘤細胞的特異性相互作用實現(xiàn)對腫瘤細胞的診斷。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

1、本發(fā)明功能化的sers造影劑是在基底上通過一種反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、通用型的點擊化學(xué)功能化修飾的方法得到的。

2、本發(fā)明功能化的sers造影劑中的拉曼活性分子和靶向配體能以單層組裝的方式共價固定于基底表面，可最大限度地提高sers造影劑對目標物的結(jié)合能力并放大檢測信號。

3、本發(fā)明使得sers造影劑應(yīng)用范圍拓寬，可選擇大量不同的具有拉曼活性的疊氮或炔基化合物作為示蹤劑、以及不同的炔基或疊氮化合物偶聯(lián)的配體作為識別單元，為真正使sers這種高靈敏度的成像技術(shù)普遍應(yīng)用于生物學(xué)成像奠定基礎(chǔ)。

四、附圖說明

圖1為本發(fā)明功能化sers造影劑制備的流程示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例1制備的sers造影劑的透射電子顯微鏡圖(右上角為對應(yīng)的光學(xué)照片)。從圖2中可以看到這種功能化的sers造影劑具有很好的單分散性。

圖3為本發(fā)明實施例1中sers造影劑對人口腔表皮癌細胞、宮頸癌細胞和肺癌細胞的sers成像。其中，激發(fā)光源波長是633nm。最左圖代表暗場光散射成像，中間圖代表sers成像，最右圖代表相應(yīng)位置的sers光譜。這一結(jié)果表明點擊功能化的sers造影劑可以應(yīng)用于腫瘤細胞的診斷。

五、具體實施方式

為了進一步理解本發(fā)明，非限定實施例如下。

實施例1：

本實施例中功能化的sers造影劑的制備方法括如下：

1、含有疊氮官能團的拉曼活性物質(zhì)的合成—5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)類疊氮化合物

將0.059g羧基活化的5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(dnba)溶解于2ml二甲亞砜中，并將80μl5.0m的氨基聚乙二醇疊氮(nh2-peg-n3)逐滴加入，室溫條件下攪拌過夜，然后向反應(yīng)液中加入大量的水，即得到桔黃色的沉淀物；經(jīng)過離心、洗滌、真空烘干，即得到dnba類疊氮化合物(dnba-n3)。

2、貴金屬納米粒子的制備—金納米空心球

取100ml超純水于250ml三口燒瓶中，依次加入100μl0.4m氯化鈷溶液和200-900μl0.1m檸檬酸鈉溶液，通入氮氣1小時后，迅速注入100-400μl1m硼氫化鈉溶液，待硼氫化鈉反應(yīng)完全后，分10次加入500μl0.1m氯金酸溶液，然后停止通入氮氣，溶液逐漸變?yōu)樯钏{色，即得粒徑為30-100nm的金納米空心球。

3、dnba-n3修飾的金納米空心球

將步驟2制備的金納米空心球離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘，40分鐘)并分散于4ml超純水中，獲得溶膠；取1ml溶膠，加入40μl0.03m的dnba-n3(二甲亞砜溶液)，室溫下攪拌3小時，然后離心、洗滌，即得到dnba-n3修飾的金納米空心球。

4、含有炔基官能團的靶向配體的合成—雙環(huán)[6.1.0]壬炔胺偶聯(lián)的葉酸分子

將0.05g葉酸分子溶解于2ml二甲亞砜中，依次加入0.025g二環(huán)己基碳二亞胺和0.013gn-羥基丁二酰亞胺，室溫攪拌30分鐘，然后將0.036g雙環(huán)[6.1.0]壬炔胺逐滴加入并攪拌過夜，過濾除去白色沉淀，再向反應(yīng)液中加入30ml水，即得到桔黃色的沉淀物；經(jīng)過離心、洗滌、冷凍干燥，即得到雙環(huán)[6.1.0]壬炔胺偶聯(lián)的葉酸分子(bcn-folate)。

5、點擊化學(xué)反應(yīng)制備功能化的sers造影劑

取1ml5.0×10^-10m步驟3制備的dnba-n3修飾的金納米空心球，加入60μl0.02mbcn-folate，室溫條件下反應(yīng)1小時，離心、洗滌，即得到功能化的sers造影劑，結(jié)構(gòu)如下：

6、功能化sers造影劑用于腫瘤細胞的成像

取200μl5.0×10^-10m步驟5制備的sers造影劑，分別加入到2ml含有人口腔表皮癌細胞、宮頸癌細胞和肺癌細胞的培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2條件下共培養(yǎng)0.5-12h，洗滌后分散于ph值7.0的pbs溶液中并進行sers成像。成像結(jié)果見圖3。

實施例2：

本實施例中功能化的sers造影劑的制備方法括如下：

1-3的制備步驟同實施例1。

4、含有炔基官能團的靶向配體的合成—丙炔胺偶聯(lián)的葉酸分子

將0.5g葉酸分子溶解于10ml二甲亞砜中，依次加入0.247g二環(huán)己基碳二亞胺和0.13gn-羥基丁二酰亞胺，室溫攪拌30分鐘，然后加入0.062g丙炔胺并攪拌24小時，過濾除去白色沉淀，再向反應(yīng)液中加入250ml水，即得到桔黃色的沉淀物；經(jīng)過離心、洗滌、真空干燥，即得到丙炔胺偶聯(lián)的葉酸分子。

5、點擊化學(xué)反應(yīng)制備功能化的sers造影劑

取1ml5.0×10^-10m步驟3制備的dnba-n3修飾的金納米空心球，加入60μl0.02m丙炔胺偶聯(lián)的葉酸分子，再依次加入50μl0.1m硫酸銅溶液和50μl0.2m抗壞血酸溶液(通過硫酸銅與抗壞血酸反應(yīng)得到催化劑一價銅離子)，室溫條件下反應(yīng)24小時，離心、洗滌，即得到功能化的sers造影劑，結(jié)構(gòu)如下：

6、功能化sers造影劑用于腫瘤細胞的成像

取200μl5.0×10^-10m步驟5制備的sers造影劑，分別加入到2ml含有人口腔表皮癌細胞、宮頸癌細胞和肺癌細胞的培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2條件下共培養(yǎng)0.5-12h，洗滌后分散于ph值7.0的pbs溶液中并進行sers成像。