本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速、定量檢測試劑，采用熒光微球、量子點等為標記物，以免疫層析方法，配合使用熒光免疫分析儀，實現(xiàn)同時檢測人血清、血漿和全血樣本中的saa、pct、crp的含量，具體是定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

血清淀粉樣蛋白a(saa)是一種急性時限反應(yīng)蛋白，血清淀粉樣蛋白a的含量濃度是反映感染性疾病早期炎癥的敏感指標，有助于診斷炎癥、評估其活性、監(jiān)控其活動及治療。

c反應(yīng)蛋白(crp)是指在機體受到感染或組織損傷時血漿中含量急劇上升的一種急性相蛋白。傳統(tǒng)觀點認為crp是一種非特異的炎癥標志物，但近十年的研究揭示了crp直接參與了炎癥與動脈粥樣硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最強有力的預(yù)示因子。

降鈣素原(pct)是診斷和監(jiān)測細菌炎性疾病感染的一個參數(shù)。pct是嚴重細菌性炎癥和真菌感染的特異性指標，而且也是膿毒癥和炎癥活動有關(guān)的多臟器衰竭的可靠指標。

研究表明在診斷炎癥、感染及相關(guān)疾病中，單一的saa、pct及crp項目的檢測并不能有效準確的診斷疾病，診斷過程中如果將saa、crp及pct等項目檢測結(jié)果與臨床資料結(jié)合，在感染性疾病的診斷上有重要的意義。

然而，目前已上市產(chǎn)品中，絕大部分是saa、crp及pct等3個項目的單獨檢測試劑盒，或者pct和crp同時檢測試劑盒，還沒有saa、crp及pct3個項目同時聯(lián)檢的試劑盒，如果需要同時檢測3個項目的結(jié)果，需要2-3次的加樣及檢測操作，如果檢測試劑盒要求的標本類型不一樣，還需要對患者重復(fù)取樣，操作上較為繁瑣，試劑及耗材的成本上有所浪費，對患者也造成了額外的負擔。

通過對現(xiàn)有文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，天津中新科炬生物制藥有限公司申請了3個相關(guān)發(fā)明專利：《一種同時定量檢測saa/pct/crp的方法》(申請?zhí)枮?01511018503.2)、《一種同時定量檢測saa/pct/crp的檢測裝置的制備方法》(申請?zhí)枮?01511018504.7)、《一種同時定量檢測saa/pct/crp的檢測裝置》(申請?zhí)枮?01511030398.4)。以上3個專利申請為相似技術(shù)，利用互相獨立的人血清淀粉樣蛋白a(saa)、人降鈣素原(pct)和c反應(yīng)蛋白(crp)檢測試紙，三聯(lián)卡殼和附帶了相應(yīng)判定方法和標準曲線的免疫層析判讀結(jié)果記錄儀，同時快速定量檢測saa/pct/crp。但其檢測方法為三聯(lián)卡，需要分別加3次樣品，加樣量和方法也各不一樣，并不能減少試劑及耗材的成本，不能實現(xiàn)真正意義上的聯(lián)檢。且其使用的是膠體金免疫層析法，其saa、pct、crp定量的檢測范圍分別為5-100mg/l，0.5-20mg/l和1-200mg/l，靈敏度較差，難以滿足臨床需求。

另外，現(xiàn)有技術(shù)中還公開了一種定量聯(lián)合檢測pct/crp/saa膠體金試紙條及其應(yīng)用的檢測裝置(申請?zhí)枮?01420797771.3)，本發(fā)明提供的試紙條，其為在底板上依次相互交錯地粘貼的樣品墊、涂覆有金標抗體的聚酯膜、包被膜及吸水紙，包被膜上設(shè)有一條包被兔抗鼠igg抗體的控制線，包被膜上還設(shè)有與所述控制線平行的三條檢測線，分別包被能與待檢抗原pct特異性結(jié)合的抗體、與待檢抗原crp特異結(jié)合的抗體以及與待檢抗原saa特異結(jié)合的抗體；所述金標抗體有三種，分別為膠體金標記的能與待檢抗原pct特異性結(jié)合的抗體、與待檢抗原crp特異結(jié)合的抗體以及與待檢抗原saa特異結(jié)合的抗體。該技術(shù)在一條試紙條上同時設(shè)置三條檢測線和一條檢測線，同步檢測三個指標，經(jīng)配套免疫熒光分析儀判斷結(jié)果，靈敏度較差，準確度較低，難以達到臨床要求的定量檢測要求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。該試劑盒通過熒光免疫層析法，配合使用熒光免疫分析儀，可以方便、準確且高靈敏度地同時檢測saa、crp、pct的含量。

為實現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明中采取了以下技術(shù)方案：一種定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，其特征在于，包括熒光免疫層析試紙條、熒光物質(zhì)，所述熒光免疫層析試紙條，底襯上設(shè)有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜的一端銜接有樣品墊，硝酸纖維素膜的另一端銜接有吸收墊；所述硝酸纖維素膜上平行設(shè)有包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測線、包被了crp單克隆抗體的檢測線和包被了pct單克隆抗體的檢測線；所述熒光物質(zhì)包括偶聯(lián)了兔igg多克隆抗體的熒光物質(zhì)、偶聯(lián)了配對saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、偶聯(lián)了配對crp單克隆抗體的熒光物質(zhì)和偶聯(lián)了配對pct單克隆抗體的熒光物質(zhì)。

進一步的，本發(fā)明提供一種定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)熒光免疫層析試紙條的制備：在硝酸纖維素膜的靠近吸收墊的一端劃上包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測線、包被了crp單克隆抗體的檢測線和包被了pct單克隆抗體的檢測線，在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜一端貼上吸收墊，在另一端貼上樣品墊，制備成試紙板，然后用切條機將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條；

2)熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液的制備：分別將兔igg多克隆抗體、配對saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、配對crp單克隆抗體和配對pct單克隆抗體偶聯(lián)熒光物質(zhì)得到抗體修飾的熒光物質(zhì)，再將上述抗體修飾的熒光物質(zhì)一起稀釋至穩(wěn)定緩沖液中得到熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液。

進一步的，本發(fā)明提供另一種定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊的制備：分別將兔igg多克隆抗體、配對saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、配對crp單克隆抗體和配對pct單克隆抗體偶聯(lián)熒光物質(zhì)得到抗體修飾的熒光物質(zhì)，再將上述抗體修飾的熒光物質(zhì)一起固相結(jié)合至樣品墊中得到熒光物質(zhì)樣品墊。

2)熒光免疫層析試紙條的制備：在硝酸纖維素膜的靠近吸收墊的一端劃上包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測線、包被了crp單克隆抗體的檢測線和包被了pct單克隆抗體的檢測線，在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜一端貼上吸收墊，然后組合上固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊，制備成試紙板，最后用切條機將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒在試紙條上設(shè)有saa、crp跟pct的檢測線，能夠通過一次加樣同步檢測saa、crp和pct3個指標，操作簡單，能減少試劑及耗材的成本。

2、本發(fā)明的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒基于熒光免疫層析技術(shù)，熒光物質(zhì)上偶聯(lián)的抗體與樣本中的抗原相結(jié)合然后再與試紙條上面的抗體相互作用，然后通過熒光分析儀將熒光物質(zhì)的不同光信號轉(zhuǎn)化為電信號得到不同的樣本檢測濃度，結(jié)果精準，能明顯改善傳統(tǒng)膠體金法肉眼判讀結(jié)果導(dǎo)致的準確性差、重復(fù)性差和效率低的問題。

3、本發(fā)明的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒采用的熒光免疫法比傳統(tǒng)膠體金法靈敏度更高；saa的檢測范圍達到0.5～200mg/l，crp的檢測范圍達到0.2～200mg/l，pct的檢測范圍達到0.1～100ug/l。saa、crp和pct的靈敏度分別達到0.5mg/l、0.2mg/l和0.1ug/l。

附圖說明

圖1為本發(fā)明定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的試紙條結(jié)構(gòu)示意圖圖；圖中，1-吸收墊；2-控制線；3-saa包被線；4-crp包被線；5-pct包被線；6-樣品墊。

圖2為設(shè)置有本發(fā)明定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的試紙條的試劑卡結(jié)構(gòu)示意圖；圖中，1-觀察槽；2-控制線；3-saa包被線；4-crp包被線；5-pct包被線；6-加樣槽。

圖3為實施例1所制得的試劑盒測試結(jié)果與西門子saa的相關(guān)線性圖。

圖4為實施例1所制得的試劑盒測試結(jié)果與西門子crp的相關(guān)線性圖。

圖5為實施例1所制得的試劑盒測試結(jié)果與梅里埃pct的相關(guān)線性圖。

圖6為實施例1所制得的試劑盒與實施例2所制得的試劑盒saa測試結(jié)果的相關(guān)線性圖。

圖7為實施例1所制得的試劑盒與實施例2所制得的試劑盒crp測試結(jié)果的相關(guān)線性圖。

圖8為實施例1所制得的試劑盒與實施例2所制得的試劑盒pct測試結(jié)果的相關(guān)線性圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的闡述。

本發(fā)明提供一種定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，包括熒光免疫層析試紙條、熒光物質(zhì)，所述熒光免疫層析試紙條，底襯上設(shè)有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜的一端銜接有樣品墊，硝酸纖維素膜的另一端銜接有吸收墊；所述硝酸纖維素膜上平行設(shè)有包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測線、包被了crp單克隆抗體的檢測線和包被了pct單克隆抗體的檢測線；所述熒光微球應(yīng)用溶液包括偶聯(lián)了兔igg多克隆抗體的熒光物質(zhì)、偶聯(lián)了配對saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、偶聯(lián)了配對crp單克隆抗體的熒光物質(zhì)和偶聯(lián)了配對pct單克隆抗體的熒光物質(zhì)。

進一步的，上述的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，是基于側(cè)向流層析及雙抗體夾心法檢測的免疫反應(yīng)。

進一步的，上述的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，所述的熒光物質(zhì)為普通熒光微球、時間分辨熒光微球、量子點等標記物。

進一步的，上述的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，所述硝酸纖維素膜的爬速為95s～180s/4cm。

進一步的，上述的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，所述樣品墊為全血過濾膜、聚酯膜、玻璃纖維中的一種。

進一步的，上述的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，配合使用內(nèi)置了saa、crp和pct反應(yīng)曲線的熒光儀來完成saa、crp、pct的定量檢測。

進一步的，上述的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，所述熒光物質(zhì)為熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液或者為固相結(jié)合到所述樣品墊上的熒光物質(zhì)。

進一步的，本發(fā)明還提供一種上述定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

1)熒光免疫層析試紙條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜一端貼上吸收墊，在另一端貼上樣品墊，在硝酸纖維素膜的靠近吸收墊的一端依次劃上羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線、saa單克隆抗體檢測線、crp單克隆抗體檢測線和pct單克隆抗體檢測線，制備成試紙板，然后用切條機將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條；

2)熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液的制備：分別將兔igg多克隆抗體、配對saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、配對crp單克隆抗體和配對pct單克隆抗體偶聯(lián)熒光物質(zhì)得到抗體修飾的熒光物質(zhì)，再將上述抗體修飾的熒光物質(zhì)一起稀釋至穩(wěn)定緩沖液中得到熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液。

進一步的，本發(fā)明提供另一種定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊的制備：分別將兔igg多克隆抗體、配對saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、配對crp單克隆抗體和配對pct單克隆抗體偶聯(lián)熒光物質(zhì)得到抗體修飾的熒光物質(zhì)，再將上述抗體修飾的熒光物質(zhì)一起固相結(jié)合至樣品墊中得到熒光物質(zhì)樣品墊。

2)熒光免疫層析試紙條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜一端貼上吸收墊，在硝酸纖維素膜的靠近吸收墊的一端依次劃上包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測線、包被了crp單克隆抗體的檢測線和包被了pct單克隆抗體的檢測線，制備成試紙半成品板，然后組合上固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊，最后用切條機將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

以下實施例中所使用的原料如無特別說明，均來自于市售。所涉及的％均為重量百分數(shù)。

實施例1

本實施例提供定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實施例中，所述熒光物質(zhì)為激發(fā)波長360nm、發(fā)射波長為615nm的時間分辨熒光微球，系包裹了稀土銪元素的熒光染料聚苯乙烯微球。

該實施例的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法包括以下步驟：

(1)時間分辨熒光微球的活化：先取1ml熒光微球加入4ml0.05mol/l、ph6.0mes溶液，用超聲波進行超聲分散，；稱取5mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)加入到微球懸浮液中，然后搖勻使之溶解；接著稱取5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)加入到微球懸浮液中，混勻后室溫攪拌反應(yīng)1小時；將反應(yīng)后的懸浮液用超聲波超聲，將混勻的微球離心處理，離心條件12000r/min,離心20min，倒掉上清液，加入0.8ml0.05mol/l、ph7.4的pb緩沖液，然后用超聲波超聲分散均勻，接著定容到1ml。

(2)活化的時間分辨熒光微球偶聯(lián)抗體：取1ml活化后的微球懸浮液，超聲分散均勻，然后邊攪拌邊滴加入兔igg多克隆抗體(購自arista公司)，優(yōu)選的抗體量為0.1～0.3mg，在2-8℃條件下，攪拌反應(yīng)過夜；加10％的bsa(終濃度在1％)進行封閉，混勻后室溫攪拌反應(yīng)2小時，離心洗滌2次，倒掉上清液，沉淀用0.8ml0.05mol/l、ph7.4的pbst溶解，并用超聲波超聲分散均勻，接著定容到1ml，4℃保存，備用。

以上述同樣方式將活化的時間分辨熒光微球分別偶聯(lián)至saa單克隆抗體(購自arista公司)、crp單克隆抗體(購自medix公司)和pct單克隆抗體(購自medix公司)，4℃保存，備用。

(3)熒光微球應(yīng)用溶液的配制：將偶聯(lián)了兔igg多克隆抗體的時間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對saa單克隆抗體的時間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對crp單克隆抗體的時間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對pct單克隆抗體的時間分辨熒光微球稀釋至穩(wěn)定緩沖液(包含3％酪蛋白、5％海藻糖、0.5％吐溫-20、3％bsa、0.1％nan3、0.3％pva，余量為0.05mol/l、ph7.4的mes緩沖液)中，4℃保存，備用。

(4)硝酸纖維素膜的制備：用包被緩沖液(包含3％甲醇、2％海藻糖，余量為0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)稀釋羊抗兔igg多克隆抗體至0.5mg/ml，稀釋saa單克隆抗體至1mg/ml，稀釋crp單克隆抗體至0.5mg/ml，稀釋pct單克隆抗體至0.8mg/ml；然后以劃線用量1μl/cm在爬速為95s/4cm的硝酸纖維素膜上依次劃上羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線、saa單克隆抗體檢測線、crp單克隆抗體檢測線和pct單克隆抗體檢測線。

包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測線、包被了crp單克隆抗體的檢測線和包被了pct單克隆抗體的檢測線相互間間隔3mm。

將包被好的硝酸纖維素膜放置于37℃真空干燥箱干燥0.5小時以上，密封室溫保存，備用。

(5)試紙條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜的靠近包被了pct單克隆抗體檢測線的一端粘貼樣品墊，在硝酸纖維素膜靠近包被了羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線的另一端粘貼吸收墊，制備成試紙板。用切條機將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

實施例2

本實施例提供定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實施例的試紙條結(jié)構(gòu)與實施例1的結(jié)構(gòu)相同，不同之處在于，實施例2中的熒光物質(zhì)為激發(fā)波長470nm～490mm、發(fā)射波長為525～560nm的熒光微球，為包裹了熒光染料的聚苯乙烯微球。

該實施例的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法包括以下步驟：

(1)熒光微球的活化：先取1ml熒光微球用超聲波進行超聲分散，超聲波100w處理時間30s；加入1ml0.8ml0.1mol/l、ph4.7的mes混勻后離心處理，離心條件12000r/min,離心20min，倒掉上清液，加入1ml0.1mol/l、ph4.7的mes緩沖液。稱取3mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)加入到微球懸浮液中，然后搖勻使之溶解；接著稱取5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)加入到微球懸浮液中，混勻后室溫攪拌反應(yīng)1小時；將反應(yīng)后的懸浮液用超聲波超聲，將混勻的微球離心處理，離心條件12000r/min,離心20min，倒掉上清液，加入0.8ml0.05mol/l、ph7.4的bbs緩沖液，然后用超聲波超聲分散均勻，接著定容到1ml。

(2)活化的熒光微球偶聯(lián)抗體：取1ml活化后的微球懸浮液，超聲分散均勻，然后邊攪拌邊滴加入兔igg多克隆抗體(購自arista公司)，優(yōu)選的抗體量為0.1～0.3mg，在2-8℃條件下，攪拌反應(yīng)過夜；加10％的bsa(終濃度在1％)進行封閉，混勻后室溫攪拌反應(yīng)2小時，離心洗滌2次，倒掉上清液，沉淀用0.8ml0.05mol/l、ph7.4的tris-hcl溶解，并用超聲波超聲分散均勻，接著定容到1ml，4℃保存，備用。

以上述同樣方式將活化的時間分辨熒光微球分別偶聯(lián)至saa單克隆抗體(購自arista公司)、crp單克隆抗體(購自medix公司)和pct單克隆抗體(購自medix公司)，4℃保存，備用。

(3)熒光微球應(yīng)用溶液的配制：同實施例1。

(4)硝酸纖維素膜的制備：同實施例1。

(5)試紙條的制備：同實施例1。

實施例3

本實施例提供定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實施例的試紙條結(jié)構(gòu)與實施例1的結(jié)構(gòu)相同，不同之處在于，實施例3中的硝酸纖維素膜2為爬速為135s/4cm的為硝酸纖維素膜。

(1)熒光微球的活化：同實施例1。

(2)活化的熒光微球偶聯(lián)抗體：同實施例1。

(3)熒光微球應(yīng)用溶液的配制：同實施例1。

(4)硝酸纖維素膜的制備：用包被緩沖液(包含3％甲醇、2％海藻糖，余量為0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)稀釋羊抗兔igg多克隆抗體至0.3mg/ml，稀釋saa單克隆抗體至0.8mg/ml，稀釋crp單克隆抗體至0.3mg/ml，稀釋pct單克隆抗體至0.6mg/ml；然后以劃線用量1μl/cm在爬速為135s/4cm的硝酸纖維素膜上依次劃上羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線、saa單克隆抗體檢測線、crp單克隆抗體檢測線和pct單克隆抗體檢測線。

(6)試紙條的制備：同實施例1。

實施例4

本實施例提供定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實施例的試紙條結(jié)構(gòu)與實施例1的結(jié)構(gòu)相同，不同之處在于，實施例3中的硝酸纖維素膜2為爬速為180s/4cm的硝酸纖維素膜。

(1)熒光微球的活化：同實施例1。

(2)活化的熒光微球偶聯(lián)抗體：同實施例1。

(3)熒光微球應(yīng)用溶液的配制：同實施例1。

(4)硝酸纖維素膜的制備：用包被緩沖液(包含3％甲醇、2％海藻糖，余量為0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)稀釋羊抗兔igg多克隆抗體至0.25mg/ml，稀釋saa單克隆抗體至0.7mg/ml，稀釋crp單克隆抗體至0.25mg/ml，稀釋pct單克隆抗體至0.5mg/ml；然后以劃線用量1.2μl/cm在爬速為180s/4cm的硝酸纖維素膜上依次劃上羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線、saa單克隆抗體檢測線、crp單克隆抗體檢測線和pct單克隆抗體檢測線。

(7)試紙條的制備：同實施例1。

實施例5

本實施例提供定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實施例中，所述熒光物質(zhì)為激發(fā)波長360nm、發(fā)射波長為615nm的時間分辨熒光微球，系包裹了稀土銪元素的熒光染料聚苯乙烯微球。

該實施例中，所述熒光物質(zhì)固相結(jié)合到樣品墊上形成固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊上。

該實施例的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法包括以下步驟：

(1)時間分辨熒光微球的活化：同實施例1。

(2)活化的時間分辨熒光微球偶聯(lián)抗體：同實施例1。

(3)固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊的制備：將偶聯(lián)了兔igg多克隆抗體的時間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對saa單克隆抗體的時間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對crp單克隆抗體的時間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對pct單克隆抗體的時間分辨熒光微球稀釋至穩(wěn)定緩沖液(包含3％酪蛋白、5％海藻糖、0.5％吐溫-20、3％bsa、0.1％nan3、0.3％pva，余量為0.05mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)中，將所配制熒光偶合物液均勻的噴涂在樣品墊上(噴液量為50ul/cm2)。將噴好熒光偶合物液的樣品墊置于37℃真空干燥箱干燥1小時以上，密封室溫保存，備用。

(4)硝酸纖維素膜的制備:同實施例1。

(5)試紙條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜的靠近包被了pct單克隆抗體檢測線的一端粘貼固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊，在硝酸纖維素膜靠近包被了羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線的另一端粘貼吸收墊，制備成試紙板。用切條機將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

實施例6

本實施例提供定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實施例中，熒光物質(zhì)為激發(fā)波長470nm～490mm、發(fā)射波長為525～560nm的熒光微球，為包裹了熒光染料的聚苯乙烯微球。

該實施例中，所述熒光物質(zhì)固相結(jié)合到樣品墊上形成固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊上，而不是保存在熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液中。

該實施例的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法包括以下步驟：

(1)熒光微球的活化：同實施例2。

(2)活化的熒光微球偶聯(lián)抗體：同實施例2。

(3)熒光偶合物樣品墊的制備：將偶聯(lián)了兔igg多克隆抗體的熒光微球、偶聯(lián)了配對saa單克隆抗體的熒光微球、偶聯(lián)了配對crp單克隆抗體的熒光微球、偶聯(lián)了配對pct單克隆抗體的熒光微球稀釋至穩(wěn)定緩沖液(包含3％酪蛋白、5％海藻糖、0.5％吐溫-20、3％bsa、0.1％nan3、0.3％pva，余量為0.05mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)中，將所配制熒光偶合物液均勻的噴涂在樣品墊上(噴液量為70ul/cm2)。將噴好熒光偶合物液的樣品墊置于37℃真空干燥箱干燥1小時以上，密封室溫保存，備用。

(4)硝酸纖維素膜的制備:同實施例1。

(5)試紙條的制備：同實施例5。

實施例7

該實施例中，所述熒光物質(zhì)為激發(fā)波長360nm、發(fā)射波長為615nm的時間分辨熒光微球，系包裹了稀土銪元素的熒光染料聚苯乙烯微球。

該實施例中，所述樣品墊粘貼靠近硝酸纖維素膜上包被了羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線的一端，而吸收墊粘貼靠近硝酸纖維素膜上包被了saa單克隆抗體檢測線的另一端。

該實施例的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法包括以下步驟：

(1)時間分辨熒光微球的活化：同實施例1。

(2)活化的時間分辨熒光微球偶聯(lián)抗體：同實施例1。

(3)固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊的制備：同實施例1。

(4)硝酸纖維素膜的制備:用包被緩沖液(包含3％甲醇、2％海藻糖，余量為0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)稀釋saa單克隆抗體至1mg/ml，稀釋crp單克隆抗體至0.5mg/ml，稀釋pct單克隆抗體至0.8mg/ml，稀釋羊抗兔igg多克隆抗體至0.4mg/ml；然后以劃線用量1μl/cm在爬速為95s/4cm的硝酸纖維素膜上依次劃上saa單克隆抗體檢測線、crp單克隆抗體檢測線、pct單克隆抗體檢測線和羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線。

包被了包被了saa單克隆抗體的檢測線、包被了crp單克隆抗體的檢測線、包被了pct單克隆抗體的檢測線和羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線相互間間隔3mm。

將包被好的硝酸纖維素膜放置于37℃真空干燥箱干燥0.5小時以上，密封室溫保存，備用。

(5)試紙條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜的靠近包被了羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線的一端粘貼樣品墊，在硝酸纖維素膜靠近包被了saa單克隆抗體檢測線的另一端粘貼吸收墊，制備成試紙板。用切條機將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

實施例8

該實施例中，所述熒光物質(zhì)為量子點，系發(fā)射波長為360nm-1300nm的量子點，或包埋了所述量子點的sio2微球。

(1)量子點標記：

a)取不同波長量子點分別用磷酸緩沖液(pbs)調(diào)ph＝5-9，加入edc(l-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺鹽酸鹽)和nhs(n-羥基硫代琥珀酸亞胺)室溫活化15-60分鐘。

b)分別對應(yīng)加入saa/pct/crp的相應(yīng)抗體，旋渦振蕩反應(yīng)30分鐘-2小時。

c)分別對應(yīng)加入bsa封閉反應(yīng)30分鐘-2小時。

d)離心純化產(chǎn)物，取沉淀用pbs緩沖液重懸分散，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)制備試劑條組分：

a)樣品墊制備:選用玻璃纖維素膜，將該膜放入含有0.1％-10％bsa和0.01％-10％tween20的pbs中浸泡，取出，干燥備用。

b)結(jié)合物墊制備：選用玻璃纖維膜切成一定規(guī)格膜塊，加入用不同波長量子點對應(yīng)標記的各抗體的混合物溶液于該膜塊上，干燥膜塊備用。

c)硝酸纖維素膜制備：用包被緩沖液(包含3％甲醇、2％海藻糖，余量為0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)稀釋saa單克隆抗體至1mg/ml，稀釋crp單克隆抗體至0.5mg/ml，稀釋pct單克隆抗體至0.8mg/ml，稀釋羊抗兔igg多克隆抗體至0.4mg/ml；然后以劃線用量1μl/cm在爬速為95s/4cm的硝酸纖維素膜上依次劃上saa單克隆抗體檢測線、crp單克隆抗體檢測線、pct單克隆抗體檢測線和羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線。

包被了包被了saa單克隆抗體的檢測線、包被了crp單克隆抗體的檢測線、包被了pct單克隆抗體的檢測線和羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線相互間間隔3mm。

將包被好的硝酸纖維素膜放置于37℃真空干燥箱干燥0.5小時以上，密封室溫保存，備用。

(3)試劑條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜的靠近包被了羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線的一端粘貼樣品墊，在硝酸纖維素膜靠近包被了saa單克隆抗體檢測線的另一端粘貼吸收墊，制備成試紙板。用切條機將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

檢測試驗例1

將實施例1所制得的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒進行測試效果檢測。

試驗中設(shè)有用來檢測實施例1所制得的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的熒光定量分析儀。

對saa進行檢測時，采用德國西門子公司的bnprospec特定蛋白分析儀及配套nlatexsaa試劑盒做檢測標準；對crp進行檢測時，采用對德國西門子公司的bnⅱ全自動特定蛋白分析儀及配套試劑做檢測標準；pct進行檢測時，采用梅里埃公司的vidas儀器及配套試劑做檢測標準。表1為采用實施例1所制得的試劑盒對部分樣品進行定量測定的結(jié)果。圖3、圖4和圖5分別為實施例1所制得的試劑盒與西門子saa、西門子crp和梅里埃pct分別檢測30份標本的相關(guān)線性。

西門子和梅里埃的儀器和配套試劑均是知名試劑盒，其檢測精度和結(jié)果公認可靠，由表1可看出實施例1所制得的試劑盒能得出與檢測標準相當?shù)慕Y(jié)果，可以進行定量測定。

進一步的由圖3、圖4和圖5分別得出實施例1所制得的試劑盒與西門子saa線性相關(guān)系數(shù)為r²＝0.98，實施例1所制得的試劑盒與西門子crp線性相關(guān)系數(shù)為r²＝0.99，實施例1所制得的試劑盒與梅里埃pct線性相關(guān)系數(shù)r²＝0.98，相關(guān)性良好，可以用于臨床診斷。

表1采用實施例1所制得的試劑盒對部分樣品進行定量測定結(jié)果

檢測試驗例2

將實施例1及實施例2所制得的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒進行測試比較。

比較激發(fā)波長360nm、發(fā)射波長為615nm的時間分辨熒光微球和激發(fā)波長470nm～490mm、發(fā)射波長為525～560nm的普通熒光微球這2種熒光標記微球?qū)Y(jié)果的影響，圖6、圖7和圖8分別得出實施例1所制得的試劑盒與實施例2所制得的試劑盒saa線性相關(guān)系數(shù)為r²＝0.98，crp線性相關(guān)系數(shù)為r²＝0.98，pct線性相關(guān)系數(shù)為r²＝0.97，相關(guān)性良好。

檢測試驗例3

將實施例1、實施例3、實施例4所制得的定量檢測saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒進行測試比較。

比較爬速為95s/4cm的硝酸纖維素膜、爬速為135s/4cm的硝酸纖維素膜、爬速為180s/4cm的硝酸纖維素膜這3種硝酸纖維素膜對結(jié)果的影響，優(yōu)選的爬速為95s/4cm的硝酸纖維素膜。

本發(fā)明試劑盒以熒光物質(zhì)，如熒光微球、時間分辨熒光微球、量子點等為標記物，以側(cè)向流層析及雙抗體夾心法為技術(shù)原理，配合使用熒光免疫分析儀，實現(xiàn)快速同時檢測saa/pct/crp的含量。標記抗體與樣本中的抗原相結(jié)合然后再與檢測卡上面的抗體相互作用，最后通過熒光分析儀將熒光微球的不同光信號轉(zhuǎn)化為電信號得到不同的樣本檢測濃度。本發(fā)明試劑盒檢測范圍：crp:0.2～200mg/l，pct:0.1～100ug/l，saa:0.5～200mg/l。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。