本技術(shù)涉及細(xì)胞外囊泡檢測，特別是涉及一種用于程序性細(xì)胞死亡配體-1膜蛋白陽性細(xì)胞外囊泡檢測的試劑盒。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞外囊泡(extracellular?vesicles，evs)是由細(xì)胞分泌的微納米膜層囊泡，包含蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等各種生物大分子。由于evs在人體生理病理過程中扮演了許多重要角色而日益成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的焦點。研究表明，腫瘤來源的evs可以作為癌癥早期診斷和療效評估的非侵入性生物標(biāo)志物。

2、evs研究領(lǐng)域的挑戰(zhàn)之一是缺乏用于evs分離的共識方法和標(biāo)準(zhǔn)的操作流程。由于evs的大小和密度與生物流體中的許多非evs顆粒重疊，因此evs分離的純度、產(chǎn)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)等，很大程度上取決于分離方法的工作原理以及輸入樣本的內(nèi)在組成。

3、目前，實驗室分離純化evs的主要方法包括傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)超高速離心法、沉淀法、尺寸排阻法、免疫磁珠法等。其中，傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)超高速離心法，因其耗時長、脂蛋白污染、需要昂貴的實驗設(shè)備等缺點，限制了其臨床應(yīng)用。沉淀法提取試劑盒耗時相對較短、所需標(biāo)本量較小，然而分離純度有限，且試劑對evs的生物活性有所影響。尺寸排阻法也已成為實驗室提取evs的主要方法之一，其具有分離速度快、產(chǎn)量高的優(yōu)點；但其基于顆粒大小的分離方法使其提取的evs純度不高。免疫磁珠法是利用抗體識別evs膜蛋白的原理進(jìn)行分離，可以分離特異的evs亞群；但分離時間長，使其應(yīng)用受限。近年來，出現(xiàn)了基于脂質(zhì)探針識別原理分離富集evs的研究，利用脂質(zhì)相容的原理達(dá)到快速分離evs的效果，但是也存在著乳糜微粒等雜質(zhì)的影響，使分離純度有所降低。隨著分離方法的不斷發(fā)展，目前已經(jīng)出現(xiàn)了不少利用微流控等方法對evs進(jìn)行分離；這些方法基于不同的作用原理，有基于粘性彈力差異、超聲、切向流過濾和非對稱流場-流分餾等進(jìn)行分離的方法。但是，這些方法都需要大型的昂貴儀器，且分離的evs產(chǎn)量有限，不適宜廣泛應(yīng)用。

4、另外，傳統(tǒng)的evs分析檢測的主要方法包括：納米顆粒跟蹤分析(nanoparticletracking?analysis，nta)可以對樣本的顆粒數(shù)和粒徑進(jìn)行統(tǒng)計分析；透射電子顯微鏡(transmission?electron?microscope，tem)可提供evs形態(tài)結(jié)構(gòu)、粒徑大小等參數(shù)；但是，nta和tem無法對evs進(jìn)行特異性表征，不能提供其表達(dá)何種特定分子標(biāo)志物。evs蛋白表達(dá)驗證或檢測方法如western?blot或elisa等方法，由于樣本需求量較大，操作步驟繁瑣，靈敏度較低，同樣不適用于臨床檢測。近些來，陸續(xù)出現(xiàn)了不少檢測evs特定標(biāo)志物的方法。例如，采用基于核酸適配體的電化學(xué)檢測方法被逐漸地應(yīng)用在evs檢測上，其具有靈敏度高、成本低、可持續(xù)監(jiān)測等優(yōu)點，但是操作時間長、過程繁瑣、抗干擾性差等缺點，使其臨床應(yīng)用受限?；诠鈱W(xué)檢測技術(shù)，有相關(guān)研究報道了一些基于表面等離子共振(surface?plasmonresonance,spr)和表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced?raman?scattering，sers)檢測evs的方法，具有免標(biāo)記并且樣本使用量少等優(yōu)點，可直接實時地檢測抗原抗體分子的相互作用。然而，該方法存在對樣本質(zhì)量和純度要求比較高、實驗設(shè)備昂貴、且需要專業(yè)的人員操作等不足。微流體技術(shù)結(jié)合微型芯片，具有高效靈敏和樣本需求量少的優(yōu)點，降低了樣品消耗和試劑成本；但是，微流控平臺需要精密的設(shè)計和昂貴的儀器想匹配，不利于在基層醫(yī)院或小實驗室開展使用，限制了實際應(yīng)用范圍。因此，應(yīng)用于科研實驗室和臨床的快速、簡便、經(jīng)濟(jì)地檢測腫瘤evs亞群試劑盒仍然較少。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的是提供一種新的用于程序性細(xì)胞死亡配體-1(programmed?celldeath-ligand?1，pd-l1)膜蛋白陽性細(xì)胞外囊泡檢測的試劑盒。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本技術(shù)采用了以下技術(shù)方案：

3、本技術(shù)的一方面公開了一種用于程序性細(xì)胞死亡配體-1膜蛋白陽性細(xì)胞外囊泡檢測的試劑盒，包括捕獲分離試劑和檢測試劑；其中，捕獲分離試劑由金屬有機(jī)骨架和結(jié)合在其表面的捕獲元件組成，捕獲元件為5’端修飾磷酸根基團(tuán)的pd-l1核酸適配體；檢測試劑包括5’端修飾膽固醇分子的dna單鏈(膽固醇-dna，cho-t)，和與dna單鏈互補的探針，探針的5’端和3’端分別修飾有熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。

4、需要說明的是，本技術(shù)的試劑盒利用pd-l1核酸適配體修飾的金屬有機(jī)骨架對程序性細(xì)胞死亡配體-1膜蛋白陽性細(xì)胞外囊泡(以下簡稱pd-l1陽性evs或pd-l1?evs)進(jìn)行捕獲和分離；然后，采用5’端修飾膽固醇分子的dna單鏈和探針對分離的pd-l1陽性evs進(jìn)行檢測，接駁熒光信號放大體系，通過熒光儀檢測熒光信號定量pd-l1陽性evs。本技術(shù)的試劑盒能夠簡便、高效的分離和檢測pd-l1陽性evs，能夠滿足科研實驗室或臨床快速、簡便、經(jīng)濟(jì)地檢測evs亞群的使用需求，解決了現(xiàn)有技術(shù)中evs亞群分離與檢測樣品需求量大、分離時間長、蛋白污染難去除、操作繁瑣、不適用于臨床應(yīng)用等問題。

5、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，金屬有機(jī)骨架為uio-66-nh2。

6、需要說明的是，金屬有機(jī)骨架(metal?organic?frameworks，mofs)是由含氧、氮等的有機(jī)配體與過渡金屬離子或團(tuán)簇通過配位鍵自組裝相互連接，形成的一類具有分子內(nèi)孔隙的周期性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的晶態(tài)多孔材料。本技術(shù)優(yōu)選采用zr合成的mofs，即uio-66-nh2。mofs合成具有明顯的方向性，可以形成多樣的框架孔隙結(jié)構(gòu)，具有多孔性、極大的比表面積、結(jié)構(gòu)與功能多樣性和不飽和的金屬位點等特點。

7、還需要說明的是，uio-66-nh2具備比重高、比表面積大、穩(wěn)定性高的優(yōu)勢，能夠滿足evs亞群的快速分離需求。uio-66-nh2表面配位不飽和位點zr4+，通過共價結(jié)合方式可快速修飾pd-l1核酸適配體捕獲元件。同時，uio-66-nh2低細(xì)胞毒性及不會破壞膜類的結(jié)構(gòu)完整性，使其能夠很好的適用于本技術(shù)的evs分離。

8、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，金屬有機(jī)骨架的粒徑為150～500nm。

9、需要說明的是，作為分離載體的mofs，要求在溶液中具有較好的分散性和均一性，能夠通過簡單的離心方法將其從溶液體系中沉淀下來；因此，本技術(shù)優(yōu)選采用粒徑為150～500nm的mofs。

10、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，pd-l1核酸適配體為seq?id?no.1所示序列。

11、需要說明的是，pd-l1核酸適配體的為5’端修飾磷酸根基團(tuán)通過與金屬有機(jī)骨架的金屬中心zr4+共價結(jié)合，在金屬骨架的表面形成一層觸手般的捕獲核酸作為pd-l1陽性evs捕獲元件。例如，當(dāng)金屬有機(jī)骨架為uio-66-nh2時，捕獲元件上的磷酸根和zr4+通過形成共價鍵連接，修飾步驟簡單快捷。較傳統(tǒng)的在固相顆粒表面修飾抗體分子捕獲evs膜上的抗原分子相比，本技術(shù)的捕獲分離試劑制備更簡單快捷，不需要使用價格高昂的特異性抗體，金屬有機(jī)骨架具有穩(wěn)定、保存時間長，且通過簡單的低速離心即可進(jìn)行evs分離等優(yōu)點。

12、可以理解，seq?id?no.1所示序列中5’端的若干個t堿基是為了便于將pd-l1核酸適配體結(jié)合到金屬有機(jī)骨架上；因此，t堿基的個數(shù)可以根據(jù)需求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。seq?idno.1所示序列的3’端，即除去5’端t堿基的其余序列，是與pd-l1膜蛋白特異性結(jié)合的核酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以知道，在此基礎(chǔ)上，在不影響與pd-l1膜蛋白特異性結(jié)合性能的情況下，可以在本技術(shù)seq?id?no.1所示序列的3’端的核酸序列基礎(chǔ)上增加或者減少若干堿基，例如，為了確保捕獲質(zhì)量和效率，這段特異性結(jié)合的核酸序列可以是27-39bp。

13、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，pd-l1核酸適配體的5’端磷酸根基團(tuán)與核酸序列之間連接有間隔物，例如，間隔物為18-o-二甲氧基三苯甲基六乙二醇-1-[(氰基乙基)-(n,n二異丙基)]-亞磷酰胺(spacer)。

14、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，本技術(shù)試劑盒的檢測試劑還包括限制性核酸內(nèi)切酶。

15、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，限制性核酸內(nèi)切酶為nt.bstnbi。

16、需要說明的是，限制性核酸內(nèi)切酶的作用是，在進(jìn)行檢測時，切除互補結(jié)合到5’端修飾膽固醇分子的dna單鏈上的探針，使報告熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光信號，被儀器檢測。nt.bstnbi是近年研究發(fā)現(xiàn)的一種可以單純酶切dna互補雙鏈中其中一條dna單鏈而另外一條dna鏈保持完整的特異性核酸內(nèi)切酶；當(dāng)然，不排除還可以采用其他具有類似功能的限制性核酸內(nèi)切酶，或者參考taqman探針的檢測方式采用相應(yīng)的酶?？梢岳斫?，本技術(shù)使用的限制性核酸內(nèi)切酶，可以直接市售購買獲得，為了使用方便，也可以選擇性的將其組合到本技術(shù)的試劑盒中。

17、還需要說明的是，本技術(shù)的檢測試劑，其基本原理是，基于脂質(zhì)識別的原理，利用膽固醇錨定大量的單鏈dna在evs表面，通過與taqman探針互補后，在特異性核酸內(nèi)切酶nt.bstnbi作用下放大熒光信號，實現(xiàn)對pd-l1陽性evs亞群的高敏檢測。

18、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，dna單鏈為seq?id?no.2所示序列。

19、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，探針為seq?id?no.3所示序列。

20、需要說明的是，dna單鏈和探針的目的是為了通過限制性核酸內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)生熒光信號；原則上，dna單鏈可以是任意序列，只要自身不會產(chǎn)生嚴(yán)重的頸環(huán)結(jié)構(gòu)即可。seqid?no.2所示序列的dna單鏈只是本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中具體采用的dna單鏈，其5’端的若干個t堿基是為了方便與膽固醇分子連接；因此，t堿基的個數(shù)可以根據(jù)需求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。seq?id?no.2所示序列的3’端是與探針互補的序列，這段序列也可以根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整。一般來說，探針的長度為15-30bp，相應(yīng)的dna單鏈的長度為探針長度的基礎(chǔ)上在5’端增加約10個t堿基即可。可以理解，在本技術(shù)的發(fā)明構(gòu)思下，還可以采用其他dna單鏈序列和與之互補配對的探針。

21、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，探針的5’端修飾有熒光基團(tuán)fam、tet、hex、rox、cy3、cy5、vic和joe中的至少一種，3’端修飾有熒光淬滅基團(tuán)bhq1、bhq-2和tamra中的至少一種。

22、需要說明的是，本技術(shù)探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)可以參考現(xiàn)有的taqman探針，不僅限于fam、tet、hex、rox、cy3、cy5、vic和joe等熒光基團(tuán)，bhq1、bhq-2和tamra等熒光淬滅基團(tuán)。可以理解，在采用某個特定的熒光基團(tuán)時，需要采用與之配對的熒光淬滅基團(tuán)，例如本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，具體采用的熒光基團(tuán)為fam，熒光淬滅基團(tuán)為bhq1。

23、本技術(shù)的另一面公開了一種用于程序性細(xì)胞死亡配體-1膜蛋白陽性細(xì)胞外囊泡的捕獲分離試劑，該捕獲分離試劑由金屬有機(jī)骨架和結(jié)合在其表面的捕獲元件組成，捕獲元件為5’端修飾磷酸根基團(tuán)的pd-l1核酸適配體。

24、本技術(shù)的再一面公開了一種用于程序性細(xì)胞死亡配體-1膜蛋白陽性細(xì)胞外囊泡的檢測試劑，該檢測試劑包括5’端修飾膽固醇分子的dna單鏈，和與dna單鏈互補的探針，探針的5’端和3’端分別修飾有熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。

25、需要說明的是，本技術(shù)用于程序性細(xì)胞死亡配體-1膜蛋白陽性細(xì)胞外囊泡的捕獲分離試劑，和用于程序性細(xì)胞死亡配體-1膜蛋白陽性細(xì)胞外囊泡的檢測試劑，實際上就是本技術(shù)試劑盒中的捕獲分離試劑和檢測試劑。因此，試劑中各成分的具體限定可以參考本技術(shù)的試劑盒，在此不累述。

26、可以理解，本技術(shù)試劑盒中的捕獲分離試劑和檢測試劑可以組合一起使用，也可以單獨使用。例如，在只需要對pd-l1陽性evs進(jìn)行分離的情況下，可以單獨使用捕獲分離試劑；在已經(jīng)采用其他方式捕獲分離pd-l1陽性evs的情況下，也可以單獨使用本技術(shù)的檢測試劑直接進(jìn)行檢測。

27、由于采用以上技術(shù)方案，本技術(shù)的有益效果在于：

28、本技術(shù)用于程序性細(xì)胞死亡配體-1膜蛋白陽性細(xì)胞外囊泡檢測的試劑盒，利用表面結(jié)合pd-l1核酸適配體的金屬有機(jī)骨架進(jìn)行pd-l1陽性evs亞群的捕獲分離，具有穩(wěn)定性好、親和力高、成本低、速度快等優(yōu)點。并且，捕獲分離的pd-l1陽性evs結(jié)構(gòu)完整，可直接接駁下游的分析檢測。進(jìn)一步的，本技術(shù)試劑盒，利用膽固醇修飾dna單鏈和與之互補的熒光標(biāo)記探針，能夠接駁熒光信號放大檢測體系，提高了檢測靈敏度。