本技術(shù)屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種單分子定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蛋白質(zhì)的變化與人類的許多疾病的生理和病理變化密切相關(guān)，在臨床醫(yī)學(xué)診斷中，通過檢測(cè)血液、尿液、腦脊液等樣本中的多種疾病標(biāo)志物蛋白質(zhì)含量的變化，能夠?qū)崿F(xiàn)疾病發(fā)生發(fā)展的預(yù)測(cè)、診斷以及治療、預(yù)后過程中的監(jiān)測(cè)，因此具有十分重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。

2、診斷檢測(cè)疾病標(biāo)志物蛋白的方法，目前主要包括酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)、側(cè)向免疫層析法(lfia)、化學(xué)發(fā)光免疫法(clia)等，以上方法都是基于免疫學(xué)中抗原抗體間的親和反應(yīng)的基本原理，將信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光或者化學(xué)發(fā)光等光學(xué)信號(hào)，最終通過光學(xué)信號(hào)的強(qiáng)度表征反應(yīng)中待測(cè)標(biāo)志物蛋白的濃度。但以上技術(shù)方法都只能檢測(cè)到樣品整體的光強(qiáng)信號(hào)，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的絕對(duì)定量，同時(shí)容易受到檢測(cè)環(huán)境中背景光強(qiáng)的干擾，在待測(cè)物濃度偏低的情況下難以得到良好的信噪比結(jié)果，也就意味著無(wú)法實(shí)現(xiàn)更高靈敏度的檢測(cè)性能。

3、近些年，美國(guó)的一家名為quanterix的公司開發(fā)了一種具有超高靈敏度的蛋白檢測(cè)方法，其所開發(fā)的simoa系統(tǒng)主要基于elisa微陣列的原理實(shí)現(xiàn)免疫信號(hào)的數(shù)字化，具體通過免疫反應(yīng)將磁珠捕獲的抗原分子使用半乳糖苷酶標(biāo)記，再將其分散到微米尺度的微孔陣列中，并使用油相進(jìn)行物理上的隔絕，讓微孔中單分子半乳糖苷酶進(jìn)行酶促反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。其檢測(cè)端與數(shù)字pcr相同，使用“0”與“1”對(duì)微孔熒光強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)記，通過“1”和“0”的計(jì)數(shù)和占比分析實(shí)現(xiàn)單分子計(jì)數(shù)以及超高靈敏度的蛋白檢測(cè)分析，因此該方法也被定義為數(shù)字elisa。但simoa技術(shù)依賴于每個(gè)微孔中的光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度根據(jù)泊松分布公式進(jìn)行待測(cè)蛋白標(biāo)志物濃度的推算，還沒有實(shí)現(xiàn)真正意義上的絕對(duì)定量。

4、因此，該領(lǐng)域中亟需一種能夠?qū)崿F(xiàn)真正意義上的絕對(duì)定量的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的在于提供全新的生物樣品中特定蛋白質(zhì)(例如蛋白標(biāo)志物)的檢測(cè)方法。該方法將待測(cè)蛋白的濃度準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化為標(biāo)記顆粒的濃度，最終通過對(duì)顆粒的計(jì)數(shù)而實(shí)現(xiàn)生物樣品的絕對(duì)定量，實(shí)現(xiàn)常規(guī)免疫檢測(cè)檢出限以下的痕量蛋白的檢測(cè)，達(dá)到單分子免疫的檢測(cè)水平。并且，可選擇性地，在免疫復(fù)合物中設(shè)計(jì)了鏈霉親和素(sa)和生物素(biotin)的親和反應(yīng)，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。

2、在一個(gè)方面，本技術(shù)提供了一種單分子定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括如下步驟：

3、(1)將含有待測(cè)蛋白質(zhì)的樣本與能夠特異性結(jié)合待測(cè)蛋白質(zhì)的納米顆粒、以及能夠特異性結(jié)合待測(cè)蛋白質(zhì)的固相介質(zhì)混合以使所述待測(cè)蛋白質(zhì)、所述納米顆粒、以及所述固相介質(zhì)形成復(fù)合物，并且通過所述固相介質(zhì)將所述復(fù)合物與所述樣本分離；

4、(2)將步驟(1)中分離的所述復(fù)合物與解離液混合，以使所述納米顆粒脫離于所述復(fù)合物；和

5、(3)對(duì)步驟(2)中脫離于所述復(fù)合物的納米顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)。

6、在某些實(shí)施方式中，所述納米顆粒和特異性結(jié)合待測(cè)蛋白質(zhì)的第一抗體/適配體相連接。

7、在某些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含鏈霉親和素標(biāo)記，并且所述第一抗體/適配體包含生物素標(biāo)記。

8、在某些實(shí)施方式中，所述納米顆粒選自由有機(jī)納米顆粒、磁性納米顆粒、稀土絡(luò)合物納米顆粒、聚合物納米微球、納米硅球、膠乳微球、金納米顆粒、氧化鐵納米顆粒、納米熒光微球和量子點(diǎn)納米顆粒組成的群組。

9、在某些實(shí)施方式中，所述固相介質(zhì)包含固相載體和與所述固相載體連接并能夠特異性結(jié)合待測(cè)蛋白質(zhì)的第二抗體/適配體。在某些實(shí)施方式中，所述固相載體選自由磁珠、板和膜組成的群組。

10、在某些實(shí)施方式中，所述第二抗體/適配體通過氨基、羧基等表面官能團(tuán)的共價(jià)結(jié)合、或非共價(jià)的被動(dòng)吸附與所述固相載體連接。

11、在某些實(shí)施方式中，步驟(1)包括如下子步驟：

12、(1-1)將含有待測(cè)蛋白質(zhì)的樣本與能夠特異性結(jié)合待測(cè)蛋白質(zhì)的第一抗體/適配體混合，其中所述第一抗體/適配體包含生物素標(biāo)記；

13、(1-2)將結(jié)合有所述第一抗體/適配體的待測(cè)蛋白質(zhì)與特異性結(jié)合待測(cè)蛋白質(zhì)的固相介質(zhì)混合以使待測(cè)蛋白質(zhì)與所述固相介質(zhì)結(jié)合；

14、(1-3)通過所述固相介質(zhì)將同時(shí)結(jié)合有所述第一抗體/適配體和所述固相介質(zhì)的待測(cè)蛋白質(zhì)從所述樣品中分離；和

15、(1-4)將同時(shí)結(jié)合有所述第一抗體/適配體和所述固相介質(zhì)的待測(cè)蛋白質(zhì)與標(biāo)記有鏈霉親和素的納米顆?；旌弦孕纬伤鰪?fù)合物。

16、在某些實(shí)施方式中，步驟(2)中所述的解離液中包含蛋白酶類，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或者蛋白酶k。

17、在某些實(shí)施方式中，步驟(2)中所述的解離液中包含強(qiáng)酸/強(qiáng)堿溶液、有機(jī)酸和變性劑中的一種或多種。

18、在某些實(shí)施方式中，所述強(qiáng)酸/強(qiáng)堿溶液為gly-hcl溶液或者naoh溶液。

19、在某些實(shí)施方式中，所述變性劑為dtt、鹽酸胍或者β-巰基乙醇。

20、在某些實(shí)施方式中，所述有機(jī)酸為水楊酸。

21、在某些實(shí)施方式中，步驟(3)中進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法選自由庫(kù)爾特原理的微孔計(jì)數(shù)、納米粒子示蹤技術(shù)、可調(diào)電阻脈沖感測(cè)以及納米流式組成的群組。在某些實(shí)施方式中，通過納米庫(kù)爾特法進(jìn)行所述計(jì)數(shù)。

22、在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括步驟(4)：利用不同濃度的待測(cè)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度值與納米顆粒計(jì)數(shù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線以及步驟(3)中得到的納米計(jì)數(shù)計(jì)算樣本中待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。

23、在另一個(gè)方面，本技術(shù)提供了一種單分子定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒包含能夠結(jié)合待測(cè)蛋白質(zhì)的納米顆粒、能夠特異性結(jié)合檢測(cè)蛋白的固相介質(zhì)以及能夠使蛋白變性和/或破壞蛋白間相互作用的解離液。

24、在某些實(shí)施方式中，所述納米顆粒和特異性結(jié)合待測(cè)蛋白質(zhì)的第一抗體/適配體相連接。

25、在某些實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含鏈霉親和素標(biāo)記，并且所述第一抗體/適配體包含生物素標(biāo)記。

26、在某些實(shí)施方式中，所述納米顆粒選自由有機(jī)納米顆粒、磁性納米顆粒、稀土絡(luò)合物納米顆粒、聚合物納米微球、納米硅球、膠乳微球、金納米顆粒、氧化鐵納米顆粒、納米熒光微球和量子點(diǎn)納米顆粒組成的群組。

27、在某些實(shí)施方式中，所述固相介質(zhì)包含固相載體和與所述固相載體連接并能夠特異性結(jié)合待測(cè)蛋白質(zhì)的第二抗體/適配體。

28、在某些實(shí)施方式中，所述固相載體選自由磁珠、板和膜組成的群組。

29、在某些實(shí)施方式中，所述第二抗體/適配體通過氨基、羧基等表面官能團(tuán)的共價(jià)結(jié)合、或非共價(jià)的被動(dòng)吸附與所述固相載體連接。

30、在某些實(shí)施方式中，所述解離液中包含蛋白酶類，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或者蛋白酶k。

31、在某些實(shí)施方式中，所述解離液中包含強(qiáng)酸/強(qiáng)堿溶液、有機(jī)酸和變性劑中的一種或多種。在某些實(shí)施方式中，所述強(qiáng)酸/強(qiáng)堿溶液為gly-hcl溶液或者naoh溶液。在某些實(shí)施方式中，所述變性劑為dtt、鹽酸胍或者β-巰基乙醇。在某些實(shí)施方式中，所述有機(jī)酸為水楊酸。

32、在另一個(gè)方面，本技術(shù)提供了如上所述的試劑盒在單分子定量檢測(cè)蛋白質(zhì)中的應(yīng)用

33、盡管本技術(shù)將在以下公開多個(gè)方面和實(shí)施方式，但是在不違背本技術(shù)主題精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以對(duì)其進(jìn)行各種等同改變和修改。本技術(shù)公開的多個(gè)方面和實(shí)施方式僅用于舉例說(shuō)明，其并非旨在限制本技術(shù)，本技術(shù)的實(shí)際保護(hù)范圍以權(quán)利要求為準(zhǔn)。除非另外指出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有與本技術(shù)所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。本技術(shù)中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利、專利申請(qǐng)均通過整體引用并入本文。