本發(fā)明涉及葡萄糖監(jiān)測(cè)，尤其是涉及一種集成提取電極的體電化學(xué)傳感器及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、糖尿病是一種威脅人類(lèi)健康和生命的世界性慢性病，隨著人們生活水平的提高，糖尿病發(fā)病率逐年升高。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)5.37億，其中中國(guó)糖尿病患者人數(shù)約1.41億，對(duì)糖尿病的預(yù)防與治療刻不容緩。

2、目前主流的血糖測(cè)量方法仍然是有創(chuàng)測(cè)量，患者通常采用手指采血測(cè)量血糖濃度。這種測(cè)量方式不僅會(huì)給患者帶來(lái)痛苦，而且做不到連續(xù)血糖測(cè)量，容易丟失血糖變化的關(guān)鍵信息。為了實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的連續(xù)血糖監(jiān)測(cè)，人們嘗試了多種方法，例如體外進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)的無(wú)創(chuàng)手段，使用植入式傳感器直接測(cè)量皮下葡萄糖的微創(chuàng)手段，對(duì)汗液、唾液或淚液等體液進(jìn)行檢測(cè)從而推算血糖濃度的無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)測(cè)量手段。然而，這些辦法都存在著一些局限性導(dǎo)致仍停留在研究階段，暫時(shí)無(wú)法實(shí)用化。

3、有研究發(fā)現(xiàn)，組織間質(zhì)液中的葡萄糖濃度與血糖濃度具有高度相關(guān)性，因此可以通過(guò)檢測(cè)組織液中葡萄糖濃度來(lái)反映血糖濃度的大小及變化。檢測(cè)方法有植入式直接檢測(cè)和透皮抽取組織液檢測(cè)兩種方式。而透皮抽取檢測(cè)相對(duì)于植入式檢測(cè)來(lái)說(shuō)由于更安全和便捷而得到了廣泛的研究。對(duì)于細(xì)胞間質(zhì)液的透皮抽取存在較多的方法，包括紅外光法、超聲法、微針?lè)?、反離子電滲法等。其中基于反離子電滲法的細(xì)胞間質(zhì)液透皮提取因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于集成而得到廣泛應(yīng)用。

4、當(dāng)前已有較多的基于反離子電滲法提取組織液結(jié)合電化學(xué)傳感器進(jìn)行血糖監(jiān)測(cè)的研究，但是結(jié)構(gòu)多為“柔性基底+電極+含酶催化水凝膠”等多層結(jié)構(gòu)，各層結(jié)構(gòu)的機(jī)械形變系數(shù)不同，當(dāng)傳感器隨皮膚發(fā)生形變時(shí)，各層形變量不同，易導(dǎo)致固定化酶的水凝膠破裂而產(chǎn)生酶泄漏，同時(shí)水凝膠隨體液累積易發(fā)生溶脹而導(dǎo)致酶泄露，酶泄露在影響傳感器準(zhǔn)確性的同時(shí)也會(huì)降低其使用壽命。

5、傳統(tǒng)的面?zhèn)鞲衅魍ǔ⒚腹潭ㄔ诠ぷ麟姌O表面，電極面積小，固定酶載量低，而酶會(huì)不斷失活，且載量低意味著較短時(shí)間內(nèi)即會(huì)失活達(dá)到傳感器所需的酶量極限，即較短的傳感器使用壽命，而且葡萄糖低催化分解速率會(huì)導(dǎo)致相鄰兩次檢測(cè)之間相互干擾。另一方面，傳統(tǒng)的面?zhèn)鞲衅魅嵝曰淄ǔ２煌笟饣蛲笟庑暂^差，體液容易累積進(jìn)而橫向流失，隨之不斷流失的葡萄糖將導(dǎo)致測(cè)量準(zhǔn)確性越來(lái)越低，較短時(shí)間內(nèi)突破準(zhǔn)確性要求區(qū)間，導(dǎo)致傳感器使用壽命短。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種集成提取電極的體電化學(xué)傳感器。

2、本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器的制備方法。

3、本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器的應(yīng)用。

4、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

5、一種集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，包括葡萄糖傳感器工作電極(2)、葡萄糖參比電極(3)、輔助電極(4)、提取電極(5)、提取對(duì)電極(6)和隔離層(7)，在隔離層(7)一側(cè)所述葡萄糖傳感器工作電極(2)、葡萄糖參比電極(3)以及輔助電極(4)和提取電極(5)并列排布在含酶水凝膠中并位于同一平面，且提取電極(5)靠近工作電極(2)設(shè)置，所述提取對(duì)電極(6)在隔離層(7)另一側(cè)不含酶水凝膠中且也在該同一平面上。

6、上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器中：

7、葡萄糖傳感器工作電極(2)用于測(cè)量葡萄糖濃度；

8、葡萄糖參比電極(3)用于在不同濃度的環(huán)境中保持相對(duì)穩(wěn)定電位；

9、輔助電極(4)用于與工作電極形成檢測(cè)回路；

10、提取電極(5)用于通過(guò)反離子電滲法透皮抽取組織液；

11、提取對(duì)電極(6)用于與提取電極對(duì)皮膚共同施加電壓；

12、隔離層(7)用于將提取電極與提取對(duì)電極絕緣隔離開(kāi)。

13、上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器的電極形狀可以任意變化以適用不同的應(yīng)用場(chǎng)景，需要保證工作電極(2)、參比電極(3)、輔助點(diǎn)擊(4)、提取電極(5)和提取對(duì)電極(6)排布在含酶水凝膠中的同一平面，提取電極(5)應(yīng)靠近工作電極(2)，提取對(duì)電極(6)需要在絕緣隔離材料的另一側(cè)的不含酶水凝膠中并同樣在同一平面。

14、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述含酶水凝膠為兩性離子水凝膠框架包埋已吸附葡萄糖氧化酶(gox)的al2o3膠體顆粒并摻雜鉑納米顆粒(ptnps)。

15、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述含酶水凝膠是由下述方法制備得到的：

16、1)以al2o3納米顆粒乳濁液為乳化劑，加入葡萄糖氧化酶溶液，采用冰水浴法，振蕩制備負(fù)載酶的納米顆粒固定化酶溶液；

17、2)將甜菜堿單體溶于羧基化纖維素納米纖維溶液中，加入交聯(lián)劑后將溶液在冰水浴條件下進(jìn)行超聲，再將交聯(lián)催化劑和熱引發(fā)劑加入溶液中，置于冰水浴中攪拌得到兩性離子聚合物溶液；

18、3)在步驟2)中得到的兩性離子聚合物溶液中加入鉑納米顆粒溶液，將溶液在冰水浴條件下混合均勻；

19、4)將納米顆粒固定化酶溶液加入步驟3)得到的兩性離子混合物溶液中，置于冰水浴中攪拌混合得到水凝膠溶液。

20、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述步驟1)中al2o3納米顆粒乳濁液濃度為0.1～5mg/ml，酶溶液濃度為10～50mg/ml；所述冰水浴溫度為-10～0℃，搖床振蕩轉(zhuǎn)速為100～200r/min，振蕩時(shí)間為15～45min。

21、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述步驟1)中al2o3納米顆粒乳濁液和酶溶液的體積比為1:1。

22、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述步驟2)中羧基化纖維素納米纖維溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％～10％羧基化纖維素納米纖維溶液，所述甜菜堿單體為甜菜堿單體活性物含量為94％～98％的粉末；所述交聯(lián)劑為亞甲基雙丙烯酰胺，催化交聯(lián)劑為四甲基乙二胺，熱引發(fā)劑為過(guò)硫酸銨；所述超聲時(shí)間為30～60min，冰水浴溫度為-10～0℃，攪拌速度為300～450rpm，攪拌時(shí)間為3～15min。

23、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述甜菜堿單體為磺酸甜菜堿或磷酸酯甜菜堿。

24、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述步驟3)中金屬納米顆粒和兩性離子聚合物溶液的體積比為0.01～0.05：1，所述冰水浴溫度為-10～0℃。

25、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述步驟4)中納米顆粒固定化酶溶液和兩性離子混合溶液的體積比為0.1-10：1，所述冰水浴溫度為-10～0℃，攪拌速度為300～450rpm，攪拌時(shí)間為3～15min；所述熱水浴溫度為30～40℃，聚合時(shí)間為24～36h。

26、上述各混合物的配比均可以按比例增加或縮減。

27、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述隔離層(7)選擇生物兼容性好的柔性絕緣材料聚二甲基硅氧烷(pdms)。

28、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述葡萄糖傳感器工作電極(2)形狀為圓形，輔助電極(4)形狀為以工作電極為圓心的一部分圓弧，參比電極(3)形狀為以工作電極為圓心的另一部分圓弧，所述輔助電極(4)與參比電極(3)不互相連接，且輔助電極(4)與參比電極(3)嵌套在工作電極(2)外。

29、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述提取電極(5)形狀為半徑大于輔助電極(4)的圓弧，嵌套在輔助電極(4)外，提取對(duì)電極(6)為圓形，所述提取電極(5)與提取對(duì)電極(6)的面積相等。

30、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述葡萄糖傳感器工作電極(2)和輔助電極(4)的材料是碳。

31、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述葡萄糖傳感器參比電極(3)的材料是ag/agcl。

32、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述提取電極(5)和提取對(duì)電極(6)的材料是ag/agcl。

33、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，所述工作電極(2)、參比電極(3)和輔助電極(4)分別通過(guò)三根導(dǎo)線(9a、9b、9c)連接至檢測(cè)器，提取電極(5)通過(guò)和提取對(duì)電極(6)分別通過(guò)兩根導(dǎo)線(9d、9e)連接至提取電路，所述導(dǎo)線是含有絕緣外層的金屬，如金、銀、鉑或銅等。

34、上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器的制備方法，由絲網(wǎng)印刷、轉(zhuǎn)印、澆注三種方法結(jié)合加工而成，具體加工步驟如下：

35、a)利用絲網(wǎng)印刷工藝，將碳漿料印刷到pet(聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)薄膜基底上，并用120℃的溫度燒結(jié)1h，形成工作電極和輔助電極；

36、b)利用絲網(wǎng)印刷工藝將ag/agcl漿料印刷到已印刷碳電極的pet薄膜基底上，并用120℃的溫度燒結(jié)1h，形成參比電極、提取電極和提取對(duì)電極；

37、c)利用3d打印加工出水凝膠澆注模具，將水凝膠溶液澆注到模具中，在不高于37℃的條件下固化后，形成厚約500μm的膜，作為傳感器的柔性基底，分別用含酶水凝膠溶液與不含酶水凝膠溶液澆注出含酶水凝膠基底和不含酶水凝膠基底；

38、d)將燒結(jié)后的工作電極、參比電極以及輔助電極和提取電極轉(zhuǎn)印到含酶水凝膠基底上，提取對(duì)電極轉(zhuǎn)印至不含酶水凝膠基底上；

39、e)利用環(huán)氧膠將各上述電極與導(dǎo)線連接；

40、f)將含酶水凝膠溶液澆注到已完成轉(zhuǎn)印的含酶水凝膠基底上，將不含酶水凝膠溶液澆注到已完成轉(zhuǎn)印的不含酶水凝膠基底上，之后在不高于37℃的條件下固化，形成厚約500μm的封裝層；

41、g)采用等離子體處理pdms表面后與含酶水凝膠及不含酶水凝膠鍵合，使兩塊水凝膠連接，pdms表面作為隔離層，得到集成提取電極的體電化學(xué)葡萄糖酶?jìng)鞲衅鳌?/p>

42、優(yōu)選的，上述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器的制備方法，所述水凝膠澆注模具為中部設(shè)有隔層的矩形容器。

43、本發(fā)明的有益效果是：

44、所述集成提取電極的體電化學(xué)傳感器，將提取電極、提取對(duì)電極和葡萄糖傳感器三電極共同集成在水凝膠中形成“水凝膠包裹電極”整體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)以含酶/鉑納米顆粒(ptnps)催化水凝膠同時(shí)作為柔性基底層和封裝層，構(gòu)造大體積催化反應(yīng)和電子傳遞空間，將電極包裹其中，使ptnps和工作電極一起組成有效工作電極體，形成自帶反應(yīng)池的體電化學(xué)葡萄糖酶?jìng)鞲衅?，使傳感器的有效工作電極空間由工作電極表面擴(kuò)展到了整個(gè)水凝膠空間；傳感器制備結(jié)合澆注、絲網(wǎng)印刷和轉(zhuǎn)印三種方法，用絲網(wǎng)印刷加工所需電極，通過(guò)澆注方法形成水凝膠基底與封裝層，通過(guò)轉(zhuǎn)印方式將電極轉(zhuǎn)印到水凝膠基底上，最后用水凝膠封裝，形成“水凝膠包裹電極”整體結(jié)構(gòu)，同時(shí)集成提取電極以應(yīng)用反離子電滲透皮提取組織間液，可實(shí)現(xiàn)組織液透皮提取與檢測(cè)一體化，具有酶載量高且不容易發(fā)生酶泄露、大工作電極比表面積、高電子遷移率、高溶解氧環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，有效的解決了連續(xù)檢測(cè)過(guò)程中相鄰兩次檢測(cè)之間干擾的問(wèn)題，對(duì)低濃度葡萄糖檢測(cè)具有高靈敏度，可以通過(guò)反離子電滲法透皮提取人體的組織液并在原位實(shí)現(xiàn)連續(xù)血糖監(jiān)測(cè)，是一種長(zhǎng)壽命抗干擾高靈敏度表皮葡萄糖傳感器。