本技術(shù)涉及鰱判定或確證，具體涉及判別野生與養(yǎng)殖鰱的代謝標(biāo)志物及用途。

背景技術(shù)：

1、鰱(hypophthalmichthys?molitrix)是我國(guó)重要的養(yǎng)殖品種，主要分布于長(zhǎng)江流域。作為“四大家魚(yú)”之一，有著病害少、肉質(zhì)好等特點(diǎn)，其種質(zhì)資源主要分布于長(zhǎng)江干支流及湖泊。由于人類(lèi)活動(dòng)的影響，長(zhǎng)江魚(yú)類(lèi)資源面臨嚴(yán)重衰退。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)針對(duì)野生與養(yǎng)殖鰱生物學(xué)性狀接近、甄別技術(shù)缺乏的問(wèn)題，首次采用超高通量液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，收集了不同的野生與養(yǎng)殖鰱群體的肌肉樣本，進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，探討了野生與養(yǎng)殖鰱代謝物的共性差異及變化，篩選出了的代謝標(biāo)志物：二甲基亞砜(cas號(hào)：67-68-5)、桉脂素(cas號(hào)：526-06-7)、苯乙烯(cas號(hào)：100-42-5)、異煙肼(cas號(hào)：54-85-3)、對(duì)甲基苯酚(cas號(hào)：106-44-5)、二甲基乙醇胺(cas號(hào)：108-01-0)。利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)的結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和邏輯回歸分析，得到邏輯回歸分析模型，根據(jù)邏輯回歸模型判斷受試樣本的來(lái)源，能夠準(zhǔn)確判別野生與養(yǎng)殖性，具有較好的敏感度和特異度。并且，本技術(shù)提供的代謝標(biāo)志物及用途能夠?yàn)橄嚓P(guān)執(zhí)法部門(mén)提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐，為加強(qiáng)長(zhǎng)江流域非法捕撈行為的監(jiān)管和打擊力度，減少對(duì)野生資源的過(guò)度捕撈，進(jìn)而更好地為管理和保護(hù)鰱資源提供技術(shù)基礎(chǔ)。

2、為此，本技術(shù)實(shí)施例至少公開(kāi)了以下技術(shù)方案：

3、第一方面，實(shí)施例公開(kāi)了代謝標(biāo)志物，其含有二甲基亞砜、桉脂素、苯乙烯、異煙肼、對(duì)甲基苯酚、二甲基乙醇胺中的至少一種。

4、在第一方面的實(shí)施例中，所述代謝標(biāo)志物包含為二甲基亞砜、桉脂素、苯乙烯、異煙肼、對(duì)甲基苯酚和二甲基乙醇胺中。

5、在第一方面的實(shí)施例中，所述代謝標(biāo)志物包含二甲基亞砜、桉脂素中的至少一種。

6、在第一方面的實(shí)施例中，所述代謝標(biāo)志物包含二甲基亞砜和桉脂素。

7、第二方面，實(shí)施例公開(kāi)了試劑組合物，其包含用于檢測(cè)第一至五方面任一所述代謝標(biāo)志物的試劑。

8、在第二方面的實(shí)施例中，所述試劑包含用于提取受試樣本的代謝物的試劑。在一些實(shí)施例中，所述試劑包含鋼珠和甲醇-水溶液(4:1，v/v)。

9、第三方面，實(shí)施例公開(kāi)了第一方面所述的代謝標(biāo)志物和/或用于檢測(cè)第二方面所述的代謝標(biāo)志物在判別野生與養(yǎng)殖鰱中的用途。

10、第四方面，實(shí)施例公開(kāi)了判別野生鰱與養(yǎng)殖鰱的方法。

11、在一些實(shí)施例中，所述方法包括測(cè)試受試樣本中第一方面所述的代謝標(biāo)志物中各個(gè)代謝標(biāo)志物含量的方法。在一些實(shí)施例中，所述受試樣本為鰱的上背部肌肉樣本。

12、在一些實(shí)施例中，所述各個(gè)代謝標(biāo)志物包括二甲基亞砜、桉脂素、苯乙烯、異煙肼、對(duì)甲基苯酚、二甲基乙醇胺。

13、在一些實(shí)施例中，所述方法還包括：獲得邏輯回歸模型和閾值；獲得受試樣本中多個(gè)代謝標(biāo)志物含量的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化值；將多個(gè)所述標(biāo)準(zhǔn)化值輸入所述邏輯回歸模型得到野生概率；根據(jù)所述野生概率與所述閾值的大小確定所述受試樣本為所述野生鰱或所述養(yǎng)殖鰱。

14、在一些實(shí)施例中，所述邏輯回歸模型為：x＝-31.258×a+3.953×b-0.236×c+0.789×d+0.725×e+3.914×f+204.608；野生概率＝1/(1+e－x)；其中a、b、c、d、e、f分別為二甲基亞砜、桉脂素、苯乙烯、異煙肼、對(duì)甲基苯酚、二甲基乙醇胺的標(biāo)準(zhǔn)化值，所述野生概率表征受試樣本為野生鰱的概率。在一些實(shí)施例中，若所述野生概率大于所述閾值，則受試樣本為野生鰱。在一些實(shí)施例中，若所述野生概率小于所述閾值，則受試樣本為養(yǎng)殖鰱。

15、在一些實(shí)施例中，閾值的確定步驟包括：根據(jù)收集的肌肉樣本的為二甲基亞砜、桉脂素、苯乙烯、異煙肼、對(duì)甲基苯酚、二甲基乙醇胺的標(biāo)準(zhǔn)化值作為訓(xùn)練集；以該訓(xùn)練集訓(xùn)練二元邏輯回歸模型，分別得到多個(gè)所述野生概率值；分別計(jì)算每一所述野生概率值的敏感性(真正例率)和1-特異性(假正例率)，將1-特異性作為橫坐標(biāo)和敏感性作為縱坐標(biāo)來(lái)繪制roc曲線(xiàn)；計(jì)算每個(gè)野生概率對(duì)應(yīng)的約登指數(shù)(約登指數(shù)＝敏感度+特異度-1)，并獲得最大約登指數(shù)，所述最大約登指數(shù)對(duì)應(yīng)的野生概率即為閾值。在一些實(shí)施例中，閾值為0.50。

16、在一些實(shí)施例中，所述各個(gè)代謝標(biāo)志物包括二甲基亞砜、桉脂素。

17、在一些實(shí)施例中，所述邏輯回歸模型為：x＝-32.698×a+0.997×b+281.034；野生概率＝1/(1+e－x)；其中a、b、c分別為二甲基亞砜、桉脂素的標(biāo)準(zhǔn)化值，所述野生概率表征受試樣本為野生鰱的概率。在一些實(shí)施例中，若所述野生概率大于所述閾值，則受試樣本為野生鰱。在一些實(shí)施例中，若所述野生概率小于所述閾值，則受試樣本為養(yǎng)殖鰱。

18、在一些實(shí)施例中，閾值的確定步驟包括：根據(jù)收集的肌肉樣本的二甲基亞砜、桉脂素的標(biāo)準(zhǔn)化值作為訓(xùn)練集；以該訓(xùn)練集訓(xùn)練二元邏輯回歸模型，分別得到多個(gè)所述野生概率值；分別計(jì)算每一所述野生概率值的敏感性(真正例率)和1-特異性(假正例率)，將1-特異性作為橫坐標(biāo)和敏感性作為縱坐標(biāo)來(lái)繪制roc曲線(xiàn)；計(jì)算每個(gè)野生概率對(duì)應(yīng)的約登指數(shù)(約登指數(shù)＝敏感度+特異度-1)，并獲得最大約登指數(shù)，所述最大約登指數(shù)對(duì)應(yīng)的野生概率即為閾值。在一些實(shí)施例中，閾值為0.50。

19、在一些實(shí)施例中，所述標(biāo)準(zhǔn)化值為將各標(biāo)志物檢測(cè)的色譜峰面積進(jìn)行歸一化處理和底數(shù)為10的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換得到的值。

20、在一些實(shí)施例中，所述方法還包括液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法。

21、在一些實(shí)施例中，該液相色譜的檢測(cè)步驟中，采用shimadzu－lc30超高效液相色譜系統(tǒng)(uhplc)進(jìn)行檢測(cè)，使用acquityhss?t3(2.1×100mm，1.8μm)(waters,milford,ma,usa)色譜柱，柱溫40℃，色譜流動(dòng)相a為0.1％甲酸水溶液，色譜流動(dòng)相b為100％乙腈溶液，洗脫模式為梯度洗脫，洗脫時(shí)間為15分鐘，流速為0.3ml/min，具體進(jìn)樣量為4μl。色譜梯度洗脫具體程序如下：0→2min，0％b；2－6min，b從0％線(xiàn)性變化至48％；6→10min，b從48％線(xiàn)性變化至100％；10→12min，b維持在100％；12→12.1min，b從100％線(xiàn)性變化至0％，12.1→15min，b維持在0％。

22、在一些實(shí)施例中，該質(zhì)譜的檢測(cè)步驟中，采用電噴霧電離(esi)進(jìn)行正離子(+)和負(fù)離子(－)模式檢測(cè)。經(jīng)uplc分離后用qe?plus質(zhì)譜儀(thermo?scientific)進(jìn)行質(zhì)譜分析，使用hesi源進(jìn)行離子化，其離子化條件如下：噴霧電壓為3.8kv(+)和3.2kv(－)；毛細(xì)管溫度為320℃；探頭加熱器溫度為350℃；鞘流氣為30arbitrary?units；輔助氣流為5arbitrary?units；s－lens射頻電平為50arbitrary?units。

23、在一些實(shí)施例中，該質(zhì)譜的檢測(cè)步驟中，質(zhì)譜采集時(shí)間為15min。母離子掃描范圍為75～1050m/z；一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70,000@m/z?200；目標(biāo)離子數(shù)為3e6；一級(jí)最大注入時(shí)間為100ms。二級(jí)質(zhì)譜分析按照下列方法采集：每次全掃描后觸發(fā)采集10個(gè)最高強(qiáng)度母離子的二級(jí)質(zhì)譜圖譜，二級(jí)質(zhì)譜分辨率為17,500@m/z?200；目標(biāo)離子數(shù)為1e5，二級(jí)最大注入時(shí)間為50ms。

24、在一些實(shí)施例中，對(duì)所述液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用得到的結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。該質(zhì)量控制步驟包括：通過(guò)混合來(lái)自所有樣本的上清液等分試樣制備質(zhì)量控制(qc)樣本；根據(jù)qc樣本的重疊堿基峰離子色譜圖(bpc)評(píng)估數(shù)據(jù)的重復(fù)性和儀器的穩(wěn)定性；使用空白樣本的bpc測(cè)定殘留物；使用所有樣本的主成分分析(pca)評(píng)估儀器分析的可靠性和穩(wěn)定性。

25、在一些實(shí)施例中，對(duì)所述液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用得到的原始數(shù)據(jù)采用msdial軟件進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。