本發(fā)明涉及材料，尤其涉及一種用于檢測crc生物標志物hnrnpa1和s100p的loc?sers平臺及其制備方法和應用。

背景技術：

1、結直腸癌(crc)是世界上最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中排名第三，嚴重威脅人類生命健康。crc的早期臨床癥狀是隱蔽的，在早期很難發(fā)現(xiàn)。大多數(shù)患者確診時已經(jīng)處于中晚期，錯過了手術的最佳時機，術后5年生存率僅為15％。因此，早期發(fā)現(xiàn)和治療對于降低癌癥患者的高死亡率和改善預后至關重要。結腸鏡檢查和成像在臨床實踐中常用于crc的早期診斷，但不適合于大規(guī)模篩查。因此，研究人員基于分子生物學技術探索了許多新的crc生物標志物。先前研究小組發(fā)現(xiàn)核不均一核糖核蛋白a1(hnrnpa1)是crc中最顯著的改變誘導蛋白之一，其在crc中表達遠遠高于正常人(121.25±71.78ng/ml)，與crc進展密切相關。此外，還有研究表明通過比較crc患者和正常人體組織，發(fā)現(xiàn)s100鈣結合蛋白p(s100p)的表達(28.47±44.86ng/ml)也遠高于正常人，后續(xù)研究也表明s100p與crc的臨床分期、淋巴結轉移和復發(fā)有關。這些證據(jù)均提示hnrnpa1和s100p可作為新的血清腫瘤標志物用于crc的早期診斷。

2、目前，已經(jīng)開發(fā)了一系列蛋白質標記物測定方法，如酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、化學發(fā)光免疫測定和熒光免疫測定。然而，這些方法繁瑣且耗時，對樣品要求高，不能用于多重分析且價格昂貴。因此，開發(fā)一種簡便、快速、超靈敏的檢測方法仍然是一個挑戰(zhàn)。近年來，表面增強拉曼散射(sers)技術因其超高靈敏度、窄譜線以及適用于多個樣品的同時檢測而在生物分析中受到廣泛關注。sers作為一種強大的光學分析技術，通過增強金屬納米結構表面微量物質的拉曼散射，提供分子的指紋信息，已成功應用于生物分子和腫瘤細胞檢測等生物醫(yī)學領域。然而，由于蛋白質的低溶解度，以及其不容易進入金屬納米結構產(chǎn)生的“熱點”間隙和粗糙表面，導致無法獲得強sers信號。為了克服這一缺點，已經(jīng)出現(xiàn)了許多使用sers技術與抗體和適體等特定生物分子相結合的傳感技術，擴展了sers在蛋白質檢測中的應用。盡管如此，現(xiàn)有的方法仍然存在檢測目標單一、靈敏度低的缺點，不適合癌癥的大規(guī)模篩查。

技術實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的主要目的是提供一種用于檢測結直腸癌(crc)生物標志物核不均一核糖核蛋白a1(hnrnpa1)和s100鈣結合蛋白p(s100p)的微流控(loc)表面增強拉曼散射(sers)平臺的制備方法，本發(fā)明提供的方法靈敏度高、特異性強、組裝過程簡單、操作簡單、便攜性強。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：

3、一種用于檢測crc生物標志物hnrnpa1和s100p的微流控loc表面增強拉曼散射sers平臺的制備方法，包括以下步驟：

4、1)將聚苯乙烯(ps)微球模板加熱后進行蝕刻，洗滌后得到硅納米陣列(sinca)；

5、2)在sinca表面濺射au薄膜，得到金硅納米陣列(aunca)；

6、3)將hnrnpa1的適配體與拉曼信號分子標記的互補單鏈ssdna1雜交形成雙鏈結構、s100p的適配體與拉曼信號分子標記的互補單鏈ssdna2雜交形成雙鏈結構，將兩種雙鏈結構均修飾到步驟2)制備得到的aunca表面，得到捕獲基底；其中，hnrnpa1的適配體與s100p的適配體的5'端均修飾有巰基；

7、4)將步驟3)所得捕獲基底嵌入載玻片，通過鍵合方式，與具有多個微通道的蓋板相結合，構建得到loc?sers平臺。

8、芯片實驗室(loc)是一個基于微流體技術的分析化學平臺，通過各種微觀結構單元(如微米到亞毫米的流體通道、反應或檢測室)操縱微米級空間中的流體，使用分析儀器可以自動完成復雜的生化學反應過程。傳統(tǒng)的loc平臺通常依賴于外部設備，如電源和注射泵，以實現(xiàn)微通道中的自發(fā)流體流動。為了克服這種情況，通常引入毛細管泵作為流體驅動元件，以實現(xiàn)自發(fā)流動并穩(wěn)定微通道中的流體流速。本發(fā)明將sers與loc平臺相結合，并引入梳狀結構通道作為毛細管泵，使sers測試更加可再生、高效、安全和環(huán)保。

9、本發(fā)明中，如圖1所示，提供了一種毛細管泵驅動的多重loc?sers平臺，結合一步識別釋放機制，以有效檢測hnrnpa1和s100p。在此之前，創(chuàng)新設計和制造了具有高密度“熱點”的致密均勻的金納米冠陣列(aunca)，以確保廣泛增強sers信號。為了滿足其要求，在aunca上修飾了在5'端具有巰基的適配體(apt-hnrnp?a1和apt-s100p)，并在適配體的互補單鏈ssdna1和ssdna2的末端標記了cy5和5-fam，用于與它們雜交以制備功能化的aunca；隨后，在嵌入檢測區(qū)域之后獲得多路復用的loc?sers平臺。在靶標存在的情況下，相應的適配體特異性捕獲hnrnpa1和s100p，導致ssdna1和ssdna2以從aunca脫落，拉曼信號強度降低。根據(jù)這一原理，可以滿足hnrnpa1和s100p的快速靈敏檢測。此外，在將結果與elisa的結果進行比較后，該loc?sers平臺在檢測臨床樣本方面的準確性得到了保證?？傊?，該方法可用于生物標志物的多重檢測，在crc早期診斷中具有潛在的應用前景。

10、進一步地，步驟1)中，所述ps微球模板的制備包括以下步驟：

11、將ps微球懸浮液、正己烷與乙醇混合，靜置以形成單層薄膜；

12、使用親水處理的硅片撈出單層薄膜，得到單層的ps微球模板；

13、其中，所述ps微球懸浮液、正己烷與乙醇的混合比為1:1～3:1～2；優(yōu)選為體積比1:2:1。

14、進一步地，步驟1)中，所述ps微球模板加熱的時間為20-40分鐘，加熱的溫度為60-80℃；優(yōu)選的，將ps微球模板置于75℃烘箱中加熱30分鐘；

15、所述蝕刻具體為采用離子蝕刻機蝕刻，具體是在200w條件下進行蝕刻；

16、所述洗滌具體為采用乙醇沖洗，洗滌時間100-300秒，優(yōu)選為180秒；

17、洗滌后還包括包括退火處理。

18、其中，所述退火處理具體為在600℃退火2小時，除去殘留物后得到sinca。

19、進一步地，步驟3)中，所述hnrnpa1的適配體的序列如seq?id?no.1所示；所述s100p的適配體的序列如seq?id?no.2所示；所述ssdna1的序列如seq?id?no.3所示；所述ssdna2的序列如seq?id?no.4所示。

20、進一步地，ssdna1的拉曼信號分子標記為花氰染料(cy5)；所述ssdna2的拉曼信號分子標記為5-羧基熒光素(5-fam)；或者兩者交換。

21、進一步地，步驟3)具體包括以下步驟：

22、3.1)將tcep與未修飾前的hnrnpa1和s100p的適配體混合20-40分鐘，得到混合液a；

23、3.2)將aunca浸入混合液a中并孵育，在aunca表面修飾適配體，得到aunca@apt-hnrnp@apt-s100p；

24、3.3)將經(jīng)步驟3.2)處理后的aunca在由ssdna1和ssdna2形成的混合液中孵育，獲得功能化的aunca捕獲基底。

25、進一步地，步驟3.2)中，還包括孵育后采用pbs溶液洗滌過量的未連接的適配體；步驟3.3)中同樣包括在孵育后用pbs溶液洗滌祛除過量的未連接的ssdna1和ssdna2。

26、進一步地，步驟3.1)中，所述tcep的濃度為40-60mm/l；hnrnpa1的適配體與s100p的適配體混合比例為1:1；tcep與hnrnpa1的適配體的混合比同樣為1:1；

27、步驟3.2)中，所述孵育溫度為36-38℃，孵育時間為10-15小時；優(yōu)選為37℃，12小時；

28、步驟3.3)中，所述ssdna1和ssdna2的混合比為1:1；且ssdna1和ssdna2的濃度均為800-1200nm/l；所述孵育時間不少于15分鐘；所述孵育溫度為36-38℃。

29、進一步地，步驟4)具體包括以下步驟：

30、4.1)將步驟3)所得捕獲基底切割后，通過激光蝕刻嵌入載玻片中，制備得到嵌入捕獲基底的載玻片；

31、4.2)據(jù)光刻設計方案(su-82025)制備硅模具，然后，將聚二甲基硅氧烷和固化劑按比例(10:1)混合，裝入硅模具中，加熱固化，加熱溫度70-90℃，加熱時間0.5-1.5小時(優(yōu)選為80℃，1小時)；冷卻、剝離后鉆孔，得到具有加樣口和廢料口的聚二甲基硅氧烷(pdms)蓋板；在玻璃板(直徑40mm)上蝕刻6個2mm方形凹槽，得到具有凹槽的玻璃板；將玻璃板和pdms蓋板用異丙醇和丙酮清洗，并干燥、等離子氧化(90秒)后浸入聚乙二醇(peg)溶液中；隨后，立即再放置于加熱板上，加熱板溫度120-160℃，放置時間20-40分鐘(優(yōu)選為150℃，30分鐘)；放置結束后，再使用異丙酮和去離子水進行清潔和干燥，得到處理后的玻璃板和具有多個微通道的pdms蓋板；

32、4.3)將步驟4.1)所得載玻片嵌入到步驟4.2)得到的玻璃板的凹槽中，再將步驟4.2)得到的具有多條微通道pdms蓋板覆蓋玻璃板上，與凹槽中的載玻片鍵合，構建得到locsers平臺。

33、需要說明的是，本發(fā)明中芯片微通道結構包括加樣區(qū)(加樣口)，反應區(qū)，分流區(qū)，出樣口，其中芯片末端梳狀結構通道(分流區(qū))提供驅動流體的毛細作用力，起到毛細管泵作用。

34、進一步地，本發(fā)明的目的之二在于提供上述任一制備方法制備得到的用于檢測crc生物標志物hnrnpa1和s100p的loc?sers平臺。

35、本發(fā)明的目的之三在于提供上述制備方法制備得到的loc?sers平臺在檢測crc生物標志物hnrnpa1和s100p中的應用。

36、進一步地，所述應用具體包括以下步驟：

37、(1)使用loc?sers平臺對血清中不同濃度(10-12-10-6g/ml)的hnrnp?a1和s100p(hnrnpa1:s100p＝1:1)進行檢測，分析其敏感性：空白對照在不含hnrnpa1和s100p的血清中進行，將不同濃度的待檢測物溶液分別加入到制備得到的loc?sers平臺的加樣口中；對反應區(qū)進行sers測試，檢測得到cy5和5-fam的信號；根據(jù)cy5在1367cm-1處的特征信號作hnrnpa1濃度的對數(shù)和sers信號強度變化量的工作曲線；根據(jù)5-fam在1176cm-1處的特征信號作s100p濃度的對數(shù)和sers信號強度變化量的工作曲線，進而得到對應的線性方程；

38、(2)收集健康人和crc患者的血清樣本，形成待檢測樣本，將待檢測樣本點樣加入到loc?sers平臺的加樣口中，獲取健康人和crc患者血清的hnrnpa1和s100p的sers光譜，檢測得到cy5和5-fam的信號；

39、(3)將步驟(2)檢測得到的血清樣本的sers信號代入步驟(1)所確定的線性方程中，測定血清樣本中hnrnpa1和s100p的表達水平；

40、(4)設立空白、cea、afp、ca125、hnrnpa1、s100p和hnrnpa1&s100p作為待檢測樣本，將待檢測樣本點樣加入到loc?sers平臺的加樣口中，分別獲取空白、cea、afp、ca125、hnrnpa1、s100p和hnrnpa1&s100p的sers光譜，檢測得到cy5和5-fam的信號并對1367cm-1和1176cm-1處的特征信號進行比較。

41、進一步地，所述hnrnpa1和s100p的濃度均為1000nm，hnrnpa1和s100p的使用量分別為10ml；反應ph值為7.6；檢測時間為15分鐘。

42、本發(fā)明有益效果至少包括：

43、(1)本發(fā)明涉及的aunca陣列具有高度的均勻性和穩(wěn)定性等優(yōu)點，并且可以大規(guī)模制備；

44、(2)本發(fā)明涉及的loc?sers平臺具有靈敏度高、特異性強、操作簡單、便攜性強等優(yōu)勢；

45、(3)本發(fā)明制備的loc?sers平臺的選擇性良好，只需要一步的樣品加入，利用適配體和目標物的強特異性原理，結合loc?sers的優(yōu)點，大大縮短了反應時間。

46、綜上所述，本研究成功開發(fā)了一種基于適配體功能化aunca的多重無泵loc?sers平臺，使用一步識別釋放機制快速特異性檢測血清中的hnrnpa1和s100p。與現(xiàn)有傳感器不同，該loc?sers平臺設計有毛細管泵和多個檢測區(qū)；在去除外部泵后，結合一步識別釋放機制，可以在15分鐘內同時檢測多個樣品中靶標的表達水平，具有良好的特異性。制備的aunca具有優(yōu)異的sers增強性能，有效提高了檢測靈敏度。在10-12-10-6g/ml范圍內，hnrnpa1和s100p的lod分別為0.031pg/ml和0.057pg/ml。同時，該平臺應用于臨床血清的結果與elisa結果高度一致。此外，通過改變適體和相應的互補鏈，該平臺可用于分析其他臨床生物標志物?？傊?，這種可重復的loc?sers平臺有望成為癌癥生物標志物早期診斷的替代工具。