本發(fā)明涉及乳清蛋白精準(zhǔn)定量領(lǐng)域，具體涉及一種基于級聯(lián)消化與特征肽段的羊源性乳清蛋白精準(zhǔn)定量方法。

背景技術(shù)：

1、乳基嬰兒配方食品中乳清蛋白的含量比較高，一般≥60％。嬰幼兒配方羊奶粉中的蛋白質(zhì)分子比牛奶小，這使得其天然成分更接近母乳，因此引發(fā)過敏的概率相對較低。

2、嬰幼兒配方羊奶粉使用有羊源性乳清蛋白。羊源性乳清蛋白作為一種乳清蛋白，同樣是多種蛋白成分的混合體系，其中各成分所占比例不同，且本身理化特性存在差異，這樣在嬰幼兒食品加工過程中易發(fā)生變性。

3、傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測方法主要依賴于蛋白質(zhì)與特定化學(xué)試劑的反應(yīng)來測定羊源性乳清蛋白的含量。其中，凱氏定氮法、雙縮脲法和比色法等方法較為常用，均需標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行確證，因此操作繁瑣，分辨率、回收率與靈敏度也較低，難以同時測定變性與不變性的羊源性乳清蛋白。此外，不同動物源乳清蛋白具有高同源性，傳統(tǒng)檢測方法難以直接在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次上進(jìn)行定性識別，將羊源性乳清蛋白和其他的動物源乳清蛋白進(jìn)行區(qū)分，且加工中的變性也影響羊源性乳清蛋白定量的準(zhǔn)確性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種基于級聯(lián)消化與特征肽段的羊源性乳清蛋白精準(zhǔn)定量方法，可準(zhǔn)確鑒定羊奶粉中羊源性乳清蛋白的含量和比率。

2、本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

3、一種基于級聯(lián)消化與特征肽段的羊源性乳清蛋白精準(zhǔn)定量方法，包括如下步驟：

4、s1，從待測羊奶粉中提取羊源性乳清蛋白后依次使用胰蛋白酶、賴氨?；鶅?nèi)切酶和谷氨酰基內(nèi)切酶進(jìn)行級聯(lián)消化，之后采集原始raw文件；

5、s2，將所述羊源性乳清蛋白對應(yīng)的肽段列表q1與原始raw文件中的肽段列表q2進(jìn)行匹配，得到與肽段列表q2相應(yīng)的蛋白質(zhì)列表，按序列覆蓋率對蛋白質(zhì)列表中的蛋白質(zhì)進(jìn)行降序排序，將前若干個蛋白質(zhì)進(jìn)行理論酶切，從得到的所有可能肽段列表中去除肽段列表q2，獲得未識別的肽段列表q3；

6、s3，以肽段列表q2對應(yīng)的肽段序列為輸入對卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練，之后利用訓(xùn)練后的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對肽段列表q3進(jìn)行分析，形成預(yù)測的ms/ms譜圖，將所述的ms/ms譜圖集成到搜索引擎maxquant中后對原始raw文件進(jìn)行分析，得到待測樣中所有可鑒定的肽段，再去除非特異性肽段，通過穩(wěn)定性、特異性、質(zhì)譜特性確定用于定量羊源性乳清蛋白的特征肽段，最后利用所述的特征肽段的含量與酶解效率得到羊源性乳清蛋白的含量及比率。

7、優(yōu)選的，s1先將待測羊奶粉用超純水溶解后依次離心、靜置，將所得中間層的清液用乙酸溶液調(diào)節(jié)ph至4.1，得到混合體系a，將混合體系a離心，將上層的乳清用超純水稀釋，先加入二硫蘇糖醇和尿素的水溶液37℃孵育1h，再加入碘乙酰胺和碳酸氫銨的水溶液20℃避光孵育30-50min，得到混合體系b，最后依次使用胰蛋白酶、賴氨酰基內(nèi)切酶和谷氨?；鶅?nèi)切酶對混合體系b進(jìn)行級聯(lián)消化。

8、進(jìn)一步，s1中待測羊奶粉和超純水的比例為(2.0-3.0)g：100ml，所述乙酸溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％，二硫蘇糖醇和尿素的水溶液中二硫蘇糖醇濃度為20mm、尿素濃度為80mm，碘乙酰胺和碳酸氫銨的水溶液中碘乙酰胺濃度為40mm、碳酸氫銨濃度為50mm。

9、進(jìn)一步，s1先在混合體系b中加入10ng/μl的胰蛋白酶水溶液反應(yīng)3h，之后添加15ng/μl賴氨?；鶅?nèi)切酶水溶液反應(yīng)3h，最后添加15ng/μl谷氨?；鶅?nèi)切酶水溶液反應(yīng)3h，胰蛋白酶水溶液、賴氨?；鶅?nèi)切酶水溶液、谷氨?；鶅?nèi)切酶水溶液和待測羊奶粉的比例為(12-15)μl：(3-5)μl：(3-5)μl：(2.0-3.0)g。

10、優(yōu)選的，s1采集原始raw文件時，使用超高效液相色譜-靜電場軌道離子阱質(zhì)譜進(jìn)行非依賴數(shù)據(jù)采集，其中色譜參數(shù)設(shè)置如下：

11、流速為0.3μl/min，柱溫為35℃，流動相a為甲酸溶液，其中甲酸占超純水質(zhì)量的0.1％，流動相b為含有甲酸的乙腈水溶液，其中乙腈和超純水的質(zhì)量比為4：1，甲酸占乙腈水溶液質(zhì)量的0.1％，梯度洗脫程序為：0-16min內(nèi)，流動相b的體積比例由2％線性增加至65％，16-70min內(nèi)，流動相b的體積比例由65％線性增加至98％，70-96min內(nèi)，流動相b的體積比例保持為98％，96-100min，流動相b的體積比例由98％線性減小至2％。

12、進(jìn)一步，s1在非依賴數(shù)據(jù)采集時，質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：

13、在正離子模式下，以3.5-4.0kv的電壓對分離的肽段混合物進(jìn)行噴霧，離子傳輸管溫度為350℃。使用多路復(fù)用-數(shù)據(jù)非依賴采集模式，將m/z?100-1500的掃描范圍劃分為70個m/z?20步長的隔離窗口，隨后將每個m/z?20步長的隔離窗口隨機(jī)分解至5段m/z?4步長的隔離窗口中，最后選擇所有隔離窗口后依次碎裂、采集所有分子離子的全部碎片離子信息，完成原始raw文件的采集。

14、優(yōu)選的，s2中用胰蛋白酶、賴氨?；鶅?nèi)切酶和谷氨?；鶅?nèi)切酶，將capra?hircus數(shù)據(jù)庫中所有與所述羊源性乳清蛋白對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，得到肽段列表q1。

15、優(yōu)選的，s3中通過one-hot編碼將每一個肽段序列轉(zhuǎn)換為1個位矩陣，行數(shù)為21，列數(shù)為25，每一行代表一種序列符號，每一列代表一個序列位置，從左上角到右下角的對角線以外的元素用零填充，隨后將64個大小為2×2的濾波器作為卷積層，將所述卷積層映射至位矩陣中進(jìn)行卷積操作，從位矩陣中對角線上兩兩相鄰的氨基酸殘基中提取得到19個特征，最后將所述的19個特征輸入至一個128維的雙向長短期記憶網(wǎng)絡(luò)中，得到肽段b、肽段y、b+2離子的強(qiáng)度與切割位點，及y+2離子的強(qiáng)度與切割位點，形成訓(xùn)練后的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

16、優(yōu)選的，s3中所述的穩(wěn)定性中，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10％以內(nèi)。

17、優(yōu)選的，s3中依次通過下面2個公式分別計算羊源性乳清蛋白的含量和羊源性乳清蛋白的比率：

18、

19、式中：cw為羊源性乳清蛋白的含量，單位為g/100g，ci為每個特征肽段i的含量，單位為mg/kg，ei為相應(yīng)特征肽段i的酶解效率，單位為％，r為羊源性乳清蛋白的比率，cc為總蛋白的含量，單位為g/100g。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

21、本發(fā)明一種基于級聯(lián)消化與特征肽段的羊源性乳清蛋白精準(zhǔn)定量方法，利用多酶體系級聯(lián)消化可進(jìn)行乳清蛋白的高效酶解，胰蛋白酶可切割賴氨酸與精氨酸殘基的羧基端肽鍵，因胰蛋白酶易遺漏酶切賴氨酸，因此利用賴氨?；鶅?nèi)切酶切割賴氨酸羧基端肽鍵，谷氨?；鶅?nèi)切酶切割天冬氨酸羧基端肽鍵，便于采集原始raw文件。利用羊源性乳清蛋白對應(yīng)的肽段列表可得到與原始raw文件中肽段列表相應(yīng)的蛋白質(zhì)列表，進(jìn)一步可得到未識別的肽段列表，卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中雙向長短期記憶網(wǎng)絡(luò)可提取肽段離子的序列結(jié)構(gòu)，能實現(xiàn)不同乳源多肽的高置信度鑒定，隨后利用訓(xùn)練后的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對未識別的肽段列表進(jìn)行分析，可得到肽段b、肽段y，b+2離子，y+2離子的強(qiáng)度與切割位點，有利于形成預(yù)測的ms/ms譜圖，該圖譜可進(jìn)一步完善搜索引擎maxquant，最后去除非特異性肽段，通過穩(wěn)定性、特異性、質(zhì)譜特性確定用于定量多個羊源性乳清蛋白的特征肽段，建立嬰幼兒配方羊奶粉中乳清蛋白的定量模型，得到羊源性乳清蛋白的含量及比率，可實現(xiàn)羊源性乳清蛋白的精準(zhǔn)定量。本發(fā)明所建立的羊源性乳清蛋白檢測方法具有高特異性、高靈敏度、高通量，并且突破了加工過程中存在的蛋白質(zhì)變性對定量準(zhǔn)確性的影響，為客觀評價嬰幼兒配方羊奶粉的質(zhì)量提供科學(xué)方法，對規(guī)范羊乳制品安全，加快嬰幼兒配方羊奶粉產(chǎn)品發(fā)展具有重要意義。