本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種稀釋液組分及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、急性呼吸道感染的致病微生物包括病毒、細(xì)菌、真菌、支原體和衣原體等。臨床上對細(xì)菌感染的診斷方法包括血相、血培養(yǎng)以及炎性因子檢測等，其中，炎性因子包括crp(c-reactive?protein，c反應(yīng)蛋白)、pct(procalcitonin，降鈣素原)、saa(serum?amyloida，血清淀粉樣蛋白a)和人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(human?neutrophil?lipocalin,hnl)，但它們存在如下缺陷中的至少一種：敏感性和特異性較差、容易受疾病復(fù)雜程度和其他外部因素影響、無法準(zhǔn)確區(qū)分是病毒感染還是細(xì)菌感染；臨床上目前沒有檢測病毒感染的特異性標(biāo)志物，主要通過血常規(guī)、炎癥標(biāo)志物(crp、pct等)、病原學(xué)(核酸、抗原、培養(yǎng)等)、血清學(xué)(igg、igm等)及影像學(xué)檢查對病毒感染進(jìn)行輔助診斷。

2、由于目前沒有高效、快捷、低成本的方法來鑒別臨床感染是細(xì)菌和/或病毒導(dǎo)致的，大多情況下醫(yī)生會依據(jù)經(jīng)驗(yàn)直接使用抗生素。

3、mxa蛋白是由mx基因編碼的分子量為75kda的胞漿內(nèi)蛋白，mxa蛋白是由i/ⅲ型干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的、屬于動態(tài)蛋白超家族的一類大分子gtp酶，除了具有動態(tài)蛋白的共性外，其最大、獨(dú)有的特性在于：對于一系列rna病毒、雙鏈dna病毒等有廣譜的抗病毒活性。mxa蛋白的抗病毒活性是通過抑制病毒早期轉(zhuǎn)錄的rna引物及mrna合成、在胞漿內(nèi)阻止病毒核衣殼進(jìn)入核內(nèi)來阻止病毒在核內(nèi)的復(fù)制兩種方式來發(fā)揮作用。因此mxa蛋白也可以作為早期診斷病毒感染，特別是rna病毒感染的高特異性和高敏感性指標(biāo)。

4、crp是一種典型的急性時相蛋白，是由肝細(xì)胞合成，在胎兒期產(chǎn)生的非母體胎盤傳遞蛋白，當(dāng)機(jī)體受感染或組織受損傷時，巨噬細(xì)胞和其他白細(xì)胞等被激活，產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6(il-6)、白細(xì)胞介素-1(il-1)、腫瘤壞死因子tnf-α等細(xì)胞因子及其他介導(dǎo)物，這些細(xì)胞因子和介導(dǎo)物到達(dá)肝臟后，刺激肝細(xì)胞和上皮細(xì)胞合成crp，因此，crp可作為細(xì)菌感染的早期快速診斷指標(biāo)，且臨床接受度較高。

5、病毒感染1-2小時后，mxa可快速升高；無病毒感染時，人體mxa的含量處于較低水平。檢測mxa在人體中的含量，有助于病毒感染的輔助診斷。而crp在細(xì)菌感染后4-6小時可快速升高，聯(lián)合檢測mxa和crp，臨床上有助于輔助鑒別診斷細(xì)菌和病毒感染。

6、目前市面上只有為數(shù)不多的mxa蛋白檢測產(chǎn)品，主要為elisa檢測試劑(enzymelinked?immunosorbent?assay，elisa)，但是，elisa存在耗時久、操作復(fù)雜、依賴酶標(biāo)儀等缺點(diǎn)。同時根據(jù)研究者的科學(xué)評估(leticia?fernandez-carballo,escadafal?etal.2021)，在265個細(xì)菌和感染診斷的標(biāo)志物中，效果較為可觀的包括如下方法：a、crp+ip-10(interferon?inducible?protein-10)+trail(tumornecrosis?factor?relatedapoptosis?inducing?ligand)聯(lián)合檢測，其臨床特異性和臨床靈敏度能夠達(dá)到94％，但該產(chǎn)品需借助于專用軟件分析；b、crp+mxa聯(lián)合檢測，臨床特異性和靈敏度能夠達(dá)到90％，是唯一一款使用膠體金側(cè)流層析法進(jìn)行檢測的產(chǎn)品(rpsdiagnostics(美國)的)，但該產(chǎn)品目前暫未在中國上市。

7、除檢測方法學(xué)以及產(chǎn)品本身的性能可以影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性外，樣本質(zhì)量也是重要的影響因素，尤其是針對血液樣本，不同實(shí)驗(yàn)和測試目標(biāo)對血液樣本放置時間的要求不同，如果血液樣本儲存不當(dāng)，會直接影響血液標(biāo)本的質(zhì)量以及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而對臨床診斷和治療產(chǎn)生不利影響?！度珖R床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中指出：若全血樣本放置時間過長，除了樣本中酶活性降低、代謝產(chǎn)物積累等化學(xué)成分將發(fā)生改變，體外紅細(xì)胞能量代謝也會受到抑制，能量不足導(dǎo)致紅細(xì)胞膜上na+-k+atp(adenosine?triphosphate，腺嘌呤核苷三磷酸)酶不能正常運(yùn)轉(zhuǎn)，從而不能將紅細(xì)胞內(nèi)逸出的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，這會造成血清鉀升高，使測定結(jié)果出現(xiàn)假性增高。此外，還可能導(dǎo)致細(xì)菌污染、細(xì)胞凋亡等，進(jìn)一步影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，必須遵守不同項(xiàng)目針對全血標(biāo)本的放置時間的規(guī)定。

8、與此同時，亦有研究表明儲存溫度以及時間對人血清蛋白生物標(biāo)志物穩(wěn)定性具有較大的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在4℃下儲存24h，大部分蛋白質(zhì)的含量沒有顯著變化，而在-20℃或-80℃的低溫下長時間儲存，某些蛋白質(zhì)的含量會顯著下降。此外，長時間儲存會導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解和聚集，影響其穩(wěn)定性。因此，對于蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的儲存和分析，應(yīng)該選擇合適的溫度和儲存時間，并盡可能快地進(jìn)行分析。對于樣本的處理，應(yīng)該盡量避免長時間的直接存儲和高溫環(huán)境，以保證蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性1。

9、mxa作為胞漿內(nèi)蛋白，需要通過采集全血樣本完成對其的測定，而由于全血樣本的理化特性，相較于血漿及血清樣本，全血樣本的儲存穩(wěn)定性明顯更低，并且mxa蛋白在長期儲存的血樣樣本中含量也會大幅下降，進(jìn)而導(dǎo)致針對狀態(tài)不可控的樣本，其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度受到較大影響。新鮮全血樣本在2-8℃儲存條件下儲存超過72小時后mxa蛋白下降超過15％，不可-20℃或-80℃凍存，凍存后檢測樣本mxa蛋白顯著下降40％～60％?；谝陨锨闆r，臨床樣本測試往往要求在48小時內(nèi)完成測試，然而對于實(shí)驗(yàn)室檢測，除去樣本收集和運(yùn)輸?shù)臅r間，實(shí)際允許測試的時間非常緊迫。另一方面，體外診斷產(chǎn)品開發(fā)過程中臨床樣本將被用于測試多種指標(biāo)，特別對一些需要累計(jì)長期測試結(jié)果的指標(biāo)比如總不精密度、再現(xiàn)性、檢出限和定量限的建立來說，超過20天穩(wěn)定的樣本尤為重要。因此，對于樣本的長期保存穩(wěn)定性研究是非常必要的，在對標(biāo)本進(jìn)行分析處理時，需根據(jù)具體檢測項(xiàng)目和需要，參照有關(guān)國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)指南和文獻(xiàn)研究建議，或是通過穩(wěn)定性研究，選擇適宜的處理方式和儲存條件，以確保項(xiàng)目檢測的可持續(xù)性和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

10、1.christensen?ei,birn?h.effect?ofstorage?temperature?andtime?on?thestability?ofserum?proteinbiomarkers.scandinavian?journal?ofclinical?andlaboratory?investigation,2011,71(7):573-579.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為改善現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種稀釋液組合物，所述稀釋液組合物可以很好的裂解血液，在使用本發(fā)明所述的稀釋液處理樣本后，在后續(xù)的檢測中不僅提升了檢測結(jié)果準(zhǔn)確性以及精準(zhǔn)度，并且可以有效延長樣本的長期儲存穩(wěn)定性，尤其適用于mxa/crp聯(lián)檢以及mxa單檢試紙條，可用于臨床急性呼吸道病毒和細(xì)菌感染的準(zhǔn)確鑒別診斷，能夠指導(dǎo)臨床合理用藥，有效改善急性呼吸道感染患者的預(yù)后，有效遏制抗生素濫用的現(xiàn)狀。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種稀釋組合物，其特征在于，包括如下組分：

3、緩沖液、表面活性劑以及金屬離子鹽，其中表面活性劑與金屬離子鹽的濃度比為5:1-10:1。

4、在一些具體的實(shí)施方式中，表面活性劑可以選自tween-20、np-40、c12e8、chaps中的至少一種。

5、進(jìn)一步地，表面活性劑的濃度為1％-5％。

6、在一些具體的實(shí)施方式中，金屬離子鹽可以選自氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂中的至少一種。

7、進(jìn)一步地，金屬離子鹽的濃度為0.01％-0.5％。

8、在一些具體的實(shí)施方式中，緩沖液可以選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、tris-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液中的至少一種。

9、進(jìn)一步地，緩沖液的濃度為10-50mmol/l。

10、在一些具體的實(shí)施方式中，稀釋液組合物的ph為5.5-8.0。

11、進(jìn)一步的，稀釋液組合物的ph為6.0-7.5。

12、第二方面，本發(fā)明提供一種如上所述的稀釋液組合物在免疫層析檢測試劑中的用途。

13、在一些具體的實(shí)施方式中，所述免疫層析檢測試劑為mxa/crp聯(lián)檢試劑或mxa單檢試劑中的至少一種。

14、在一些具體的實(shí)施方式中，當(dāng)試劑為mxa/crp聯(lián)檢免疫層析試劑時，所述試劑包括試紙條，所述試紙條包括結(jié)合墊以及nc膜，其中nc膜上設(shè)置有c線、t1線、t2線和t3線，c線上具有crp抗原，t1線上具有mxa抗體，t2線上具有crp抗體，t3線上具有dnp抗體。

15、在一些具體的實(shí)施方式中，結(jié)合墊上設(shè)置有示蹤粒子-抗體復(fù)合物，示蹤粒子-抗體復(fù)合物包括示蹤粒子-crp抗體復(fù)合物、示蹤粒子-mxa抗體復(fù)合物和示蹤粒子-dnp-bsa。

16、進(jìn)一步地，示蹤粒子可以選自膠體金粒子、膠體鉑粒子、彩色乳膠粒子、熒光微球、磁性粒子或納米碳中的至少一種。

17、進(jìn)一步地，示蹤粒子為熒光微球。

18、在一些具體的實(shí)施方式中，當(dāng)試劑為mxa單檢免疫層析試劑時，所述試劑包括試紙條，所述試紙條包括結(jié)合墊以及nc膜，其中nc膜上設(shè)置有c線、t1線，c線上具有dnp抗體，t1線上具有mxa抗體。

19、在一些具體的實(shí)施方式中，結(jié)合墊上設(shè)置有示蹤粒子-抗體復(fù)合物，示蹤粒子-抗體復(fù)合物包括示蹤粒子-mxa抗體復(fù)合物和示蹤粒子-dnp-bsa；

20、進(jìn)一步地，示蹤粒子選自膠體金粒子、膠體鉑粒子、彩色乳膠粒子、熒光微球、磁性粒子或納米碳中的至少一種。

21、進(jìn)一步地，示蹤粒子為熒光微球。

22、在一些具體的實(shí)施例中，試紙條還包括襯底、樣品墊和吸水墊，其中樣品墊、結(jié)合墊、nc膜和吸水墊依次搭接，且所述樣品墊、結(jié)合墊、nc膜和吸水墊均設(shè)置在襯底上。

23、本發(fā)明的檢測原理如下：測試時，樣本中的待測物與樣品墊上熒光微球標(biāo)記的抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，借助毛細(xì)作用移行至檢測線(t)及質(zhì)控線(c)形成有熒光信號的條帶，配合免疫定量分析儀器使用，通過采集檢測線(t)和質(zhì)控線(c)信號進(jìn)行分析處理(與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對)，計(jì)算出樣本中crp、mxa的含量。

24、有益效果

25、本發(fā)明的目的在于提供一種二合一功能的樣本稀釋液，作為匹配試劑盒檢測mxa蛋白的樣本裂解液和mxa樣本長期保存的預(yù)處理稀釋液。本發(fā)明提供的稀釋液可以裂解樣本中細(xì)胞以達(dá)到釋放胞漿內(nèi)mxa蛋白、暴露目標(biāo)物被捕獲檢測的作用，同時該稀釋液也可用于預(yù)處理樣本，有利于提高樣本的長期穩(wěn)定性，用于mxa蛋白的長期監(jiān)測指標(biāo)檢測。這種預(yù)處理樣本以達(dá)到長期保存樣本的方式，為樣本穩(wěn)定性不佳的產(chǎn)品提供了很好的解決思路。