本發(fā)明屬于分析方法，涉及一種青磚茶中8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素的提取及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、茶是世界上最受歡迎的飲料之一，具有多種藥理作用，如抗癌、降血糖和抗肥胖，其消費(fèi)量與咖啡和可可相當(dāng)。青磚茶，作為中國(guó)茶葉文化的珍貴遺產(chǎn)之一，一直以來(lái)都備受茶葉研究者的關(guān)注，以其獨(dú)特的制作工藝和保存方式而聞名，與傳統(tǒng)的散茶或散茶餅相比，青磚茶的形態(tài)獨(dú)特，呈現(xiàn)為磚狀塊茶，通常制成方形或矩形，厚度不一，外觀顏色多為深綠、墨綠、甚至咖啡色。具有減肥、降血脂、抗氧化、調(diào)節(jié)新陳代謝等作用。兒茶素(catechins)和茶黃素(flavonols)屬于茶多酚類(lèi)，是茶葉中的主要生物活性成分之一，這些化合物不僅賦予茶葉獨(dú)特的風(fēng)味和香氣，還具有許多潛在的健康益處，可用于鑒定微量茶。迄今為止報(bào)道的兒茶素和茶黃素對(duì)健康的益處，有較熟悉的抗炎、抗高血壓、抗肥胖和抗癌作用。此外，還有抗氧化、抗真菌、抗病毒、對(duì)心血管健康和微血管循環(huán)的影響。

2、青磚茶屬于后發(fā)酵茶，通常需要一段時(shí)間的貯存和陳化才能達(dá)到最佳的風(fēng)味品質(zhì)，而這一過(guò)程中青磚茶中的化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生變化。不同年份的青磚茶價(jià)值不同，年份越長(zhǎng)，其價(jià)格越貴，因?yàn)檫@個(gè)原因，市場(chǎng)上往往存在以次充好，低年份冒充高年份青磚茶現(xiàn)象，以次來(lái)謀取暴利，甚至是假冒偽劣青磚茶，對(duì)人們的身體健康產(chǎn)生了負(fù)面影響。因此,研究不同年份的青磚兒茶素和茶黃素可以揭示其成分隨時(shí)間的演變特點(diǎn)，有助于了解其潛在的健康益處，也可以幫助鑒定不同年份青磚茶。

3、綜上所述，分析青磚茶中8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素的含量研究對(duì)于深入了解青磚茶的品質(zhì)、風(fēng)味、保有方式以及其潛在的健康效應(yīng)都具有重要的價(jià)值。目前用于分析茶葉中這些酚類(lèi)化合物的分析方法有高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)。但是尚未有關(guān)于青磚茶中8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素的含量鑒定的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種青磚茶中8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素的提取及檢測(cè)方法，旨在解決上述的技術(shù)問(wèn)題。

2、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種青磚茶中8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素的提取方法，包括以下步驟：將茶磚研磨成細(xì)粉，取細(xì)粉溶于甲醇水溶液中，所述甲醇水溶液中的甲醇體積占比為54％-66％，所述細(xì)粉與所述甲醇水溶液的質(zhì)量體積比為18-22mg/ml，然后81-99℃加熱13.5-16.5分鐘，離心取上清液，過(guò)濾，保留過(guò)濾液；

3、或，將茶磚研磨成細(xì)粉，取細(xì)粉溶于水中，然后81-99℃加熱27-33分鐘，離心取上清液，過(guò)濾，保留過(guò)濾液。

4、優(yōu)選的，包括以下步驟：將茶磚研磨成細(xì)粉，取細(xì)粉溶于甲醇水溶液中，所述甲醇水溶液中的甲醇體積占比為60％，所述細(xì)粉與所述甲醇水溶液的質(zhì)量體積比為20mg/ml，然后90℃加熱15分鐘，離心取上清液，過(guò)濾，保留過(guò)濾液。

5、優(yōu)選的，包括以下步驟：將茶磚研磨成細(xì)粉，取細(xì)粉溶于水中，然后90℃加熱30分鐘，離心取上清液，過(guò)濾，保留過(guò)濾液。

6、進(jìn)一步的，還包括以下步驟：將得到的所述過(guò)濾液揮干成粉末，-20℃下保存。

7、本發(fā)明還提供一種青磚茶中8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

8、s1.采用上述的提取方法提取青磚茶樣品中8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素；

9、s2.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：配制內(nèi)標(biāo)溶液和系列標(biāo)準(zhǔn)工作液并進(jìn)行l(wèi)c-ms分析，以保留時(shí)間和質(zhì)荷比對(duì)分離出的組分進(jìn)行定性分析，以濃度為橫坐標(biāo)，以各兒茶素和茶黃素的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，獲得8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素的線(xiàn)性回歸方程；

10、s2.樣品檢測(cè)：取步驟s1中加入內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)行l(wèi)c-ms分析，得到組分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入s2得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中得到其濃度。

11、進(jìn)一步的，步驟s2中的配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液包括以下步驟：

12、a.配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱(chēng)取8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素標(biāo)準(zhǔn)品(各0.010g)，8個(gè)所述兒茶素分別為沒(méi)食子兒茶素(gc)、兒茶素沒(méi)食子酸酯(egc)、兒茶素(c)、表兒茶素(ec)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(egcg)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(gcg)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ecg)和兒茶素沒(méi)食子酸酯(cg)，4個(gè)所述茶黃素分別為茶黃素(tf1)、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯(tf2a)、茶黃素-3,3'-沒(méi)食子酸酯(tf3)和茶黃素-3'-沒(méi)食子酸酯(tf2b)，用超純水配制成1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；

13、b.配制標(biāo)準(zhǔn)工作液：取步驟s1中的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50％甲醇水溶液分別配制12個(gè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液，12個(gè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液的濃度如下：所述沒(méi)食子兒茶素的濃度為38.961、2.435、1.218、0.609、0.304、0.152μg/ml，兒茶素沒(méi)食子酸酯的濃度為93.506、23.377、5.844、2.922、0.731、0.365μg/ml，兒茶素的濃度為23.377、1.461、0.731、0.365、0.183、0.091μg/ml，表兒茶素的濃度為46.753、11.688、1.461、0.731、0.365、0.183μg/ml，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的濃度為311.688、9.740、4.870、2.435、1.218、0.609μg/ml，沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的濃度為46.753、11.688、1.461、0.731、0.365、0.183μg/ml，表兒茶素沒(méi)食子酸酯的濃度為101.299、6.331、3.166、1.583、0.791、0.396μg/ml，兒茶素沒(méi)食子酸酯的濃度為0.974、0.244、0.122、0.061、0.030、0.015μg/ml，茶黃素的濃度為7.792、0.487、0.244、0.122、0.061、0.030μg/ml，茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯的濃度為15.584、0.974、0.487、0.244、0.122、0.061μg/ml，茶黃素-3,3'-沒(méi)食子酸酯的濃度為7.792、0.487、0.244、0.122、0.061、0.030μg/ml，茶黃素-3'-沒(méi)食子酸酯的濃度為7.792、0.487、0.244、0.122、0.061、0.030μg/ml，過(guò)濾。

14、進(jìn)一步的，步驟s2中配制內(nèi)標(biāo)溶液包括以下步驟：將內(nèi)標(biāo)物對(duì)乙酰氨基酚用純甲醇溶解，配得1mg/ml的is儲(chǔ)備液，再用50％甲醇水溶液稀釋為1μg/ml工作液。

15、進(jìn)一步的，所述液相色譜的條件為：采用shim-pack?vp-ods柱，250×4.6mm，粒徑5.0μm；進(jìn)樣體積為5μl，流動(dòng)相a為0.5％甲酸水，流動(dòng)相b為甲醇；柱溫35℃；采用梯度洗脫，流速為0.2ml/min。

16、進(jìn)一步的，所述質(zhì)譜的條件為：離子源：電噴霧；檢測(cè)模式：正離子模式、多反應(yīng)檢測(cè)模式定量分析；掃描模式：一級(jí)質(zhì)譜q3掃描，質(zhì)譜掃描范圍m/z為100～600、二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)物離子掃描；掃描時(shí)間：0.5min；dl溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；電噴霧電壓：3.5kv；霧化氣體：氮?dú)?；碰撞氣體：高純氮?dú)?；碰撞氣壓力?30kpa；霧化氣流速：3.0l/min；干燥器流量：15.0l/min。

17、進(jìn)一步的，所述梯度洗脫的方法如下：初始至10min時(shí)流動(dòng)相a體積為80～49％，流動(dòng)相b的體積為20～51％；10.00～18.00min時(shí)流動(dòng)相a體積為49～49％，流動(dòng)相b的體積為51～51％；18.00～19.00min時(shí)流動(dòng)相a體積為49～0％，流動(dòng)相b的體積為51～0％。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

19、1.本發(fā)明建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的high-performance?liquidchromatography-tandem?mass?spectrometry(hplc-ms/ms)方法測(cè)定青磚茶中8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素含量，通過(guò)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最佳提取條件：確定甲醇的最佳提取條件是：甲醇濃度60％，90℃，15min；水提的最佳條件是：90℃，30min。不同提取方法(甲醇提取和水提取)對(duì)8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素含量影響較大，使用甲醇提取8個(gè)兒茶素和4個(gè)茶黃素含量大于水提法。本發(fā)明通過(guò)改變不同的提取方法，從而改變提取工藝，找到最佳提取方法，最大化地提取這12個(gè)活性物質(zhì)，為后期青磚茶開(kāi)發(fā)和利用提供最佳提取方法，以實(shí)現(xiàn)資源利用最大化。