本發(fā)明屬于光譜學(xué)、光纖傳感、分析化學(xué)、生命健康、分子生物學(xué)，具體涉及一種用于原位檢測(cè)的光纖型表面增強(qiáng)拉曼散射和表面增強(qiáng)熒光雙模式傳感器。

背景技術(shù)：

1、表面增強(qiáng)熒光(surface?enhanced?fluorescence,sef)指在金屬納米結(jié)構(gòu)的作用下，熒光物質(zhì)的輻射行為受到調(diào)控，輻射強(qiáng)度相較于自由狀態(tài)下熒光物質(zhì)的輻射強(qiáng)度有所增加，因此擁有更高的靈敏度，可實(shí)現(xiàn)更低豐度的物質(zhì)檢測(cè)。但熒光具有較寬的發(fā)射峰，因此在復(fù)雜體系中不同物質(zhì)的熒光光譜可能會(huì)高度重疊，導(dǎo)致檢測(cè)準(zhǔn)確性有所降低。

2、拉曼散射是指一定頻率的激光照射到樣品表面時(shí)，物質(zhì)中的分子與光子發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，振動(dòng)態(tài)發(fā)生不同方式和程度的改變，然后散射出不同頻率的光。頻率的變化決定于散射物質(zhì)的本身特性，不同種類的原子團(tuán)振動(dòng)的方式是獨(dú)一的，因此可以產(chǎn)生與入射光頻率有特定差值的散射光，其光譜就稱為“指紋光譜”，可以由此鑒別出組成物質(zhì)的分子種類。拉曼散射屬于非彈性散射，每106～108個(gè)發(fā)生散射的光子中一個(gè)發(fā)生拉曼散射，所以它的強(qiáng)度很低。表面增強(qiáng)拉曼散射(surface?enhanced?raman?scattering,sers)是在普通的拉曼散射的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)，通常需要分析物吸附在au、ag、cu等貴金屬納米結(jié)構(gòu)表面后才能產(chǎn)生，此時(shí)拉曼信號(hào)會(huì)大幅增強(qiáng)，對(duì)于合適的分析物增強(qiáng)因子可以達(dá)到106～1015，對(duì)希望將拉曼光譜作為一種非常靈敏、信息量大的分析方法的研究者來說具有巨大吸引力。

3、標(biāo)志物早期檢測(cè)具有重要意義。它可以輔助疾病的診斷，雖然不能單獨(dú)確診，但對(duì)于已經(jīng)存在疑似疾病的患者來說，檢測(cè)生物標(biāo)志物可以了解疾病的類型、部位和病程，有助于制定科學(xué)合理的治療方案。其次，生物標(biāo)志物可以作為療效監(jiān)測(cè)的指標(biāo)，通過定期檢測(cè)其水平變化，可以判斷治療效果、調(diào)整治療方案，以及預(yù)測(cè)預(yù)后。但是生物標(biāo)志物往往具有豐度極低的特點(diǎn)，因此，開發(fā)出一種高靈敏、高準(zhǔn)確性的生物標(biāo)志物早期檢測(cè)方法對(duì)于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)、治療和預(yù)后具有重要意義。近年來的研究表明，在心血管疾病、癌癥和代謝性疾病中，許多病理生理過程都高度依賴于mirnas。由于其作為相關(guān)疾病早期診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物的潛力，mirnas已經(jīng)獲得了巨大的興趣。現(xiàn)有技術(shù)提供了許多mirna的檢測(cè)方法，例如：定量聚合酶鏈反應(yīng)(qpcr)、northern印跡雜交(northern?blot)、熒光探針檢測(cè)、環(huán)狀滾動(dòng)擴(kuò)增(rolling?circle?amplification,rca)，但mirnas具有體積小、序列重復(fù)度高與體外易降解的特點(diǎn)，而上述分析方法通常需要大量的檢測(cè)樣品和復(fù)雜的分析程序，這些都不可避免地造成了樣品和人力的損失。基于以上原因，一種方便、快速、準(zhǔn)確的原位mirnas檢測(cè)方法，對(duì)疾病監(jiān)測(cè)和后續(xù)治療決策至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于原位檢測(cè)的光纖型表面增強(qiáng)拉曼散射和表面增強(qiáng)熒光雙模式傳感器。

2、本發(fā)明的用于原位檢測(cè)的光纖型表面增強(qiáng)拉曼散射和表面增強(qiáng)熒光雙模式傳感器包括錐形光纖、金納米顆粒aunps和捕獲探針；

3、所述錐形光纖由石英多模光纖熔融拉制而成，所述錐形光纖由未拉錐端和拉錐端構(gòu)成，所述石英多模光纖的纖芯為純石英玻璃，直徑105μm，包層為摻氟石英玻璃，直徑為125μm；

4、所述錐形光纖表面羥基化后修飾氨基，然后通過氨基與所述aunps連接；

5、所述捕獲探針由功能化的dna鏈i和dna鏈ii堿基互補(bǔ)配對(duì)形成，所述捕獲探針固定連接在所述aunps表面；

6、所述dna鏈i的序列為5'-gcgagctagcttatcagactgctcgctttt?tt-3'；所述dna鏈ii的序列為5'-tcaacatcagtctgataagcta-3'，所述dna鏈i的5'端修飾熒光基團(tuán)，3'端修飾巰基。

7、進(jìn)一步的，所述熒光基團(tuán)選自cy5、cy5.5、cy3或rox。

8、進(jìn)一步的，所述錐形光纖錐未拉錐端包層直徑為125μm，纖芯直徑為105μm，所述錐形光纖錐過渡區(qū)長(zhǎng)度為600±10μm，錐腰直徑≤1μm，錐腰長(zhǎng)度為100±5μm。

9、進(jìn)一步的，所述雙模式傳感器的制備方法具體包括以下步驟：

10、1)將石英多模光纖剝?nèi)?cm涂覆層后進(jìn)行拉錐，并在拉錐端切斷得到錐形光纖；

11、2)將拉錐端置于食人魚溶液中反應(yīng)，獲得羥基化錐形光纖；

12、3)將所述羥基化錐形光纖修飾氨基，獲得氨基化錐形光纖；

13、4)將所述氨基化錐形光纖清洗干燥后置于aunps膠體懸濁液中孵育，獲得aunps修飾的錐形光纖；

14、5)向所述dna鏈i中加入tcep，活化巰基，隨后置入aunps修飾的錐形光纖，孵育，然后去除非共價(jià)結(jié)合的dna，隨后加入與dna鏈i等量的dna鏈ii孵育，再次清洗，可獲得所述雙模式傳感器。

15、在本發(fā)明的一具體實(shí)施方式中，錐形光纖由多模光纖熔融拉制而成，拉制后過渡區(qū)長(zhǎng)度為600μm，錐腰直徑≤1μm，錐腰長(zhǎng)度為100μm；多模光纖拉錐端首先通過食人魚溶液清洗實(shí)現(xiàn)羥基化，隨后利用硅烷劑aptes進(jìn)行硅烷化修飾氨基，再將上述器件浸入帶有負(fù)電荷的aunps膠體，進(jìn)一步修飾了金納米顆粒(aunps)，在光纖錐表面形成了大量納米間隙，以此作為sers與sef基底，最后與3′巰基修飾5′熒光基團(tuán)修飾的dna混合孵育并結(jié)合形成mir-21捕獲探針，完成雙模式傳感器的制備。

16、本發(fā)明還提供了一種表面增強(qiáng)熒光光譜的檢測(cè)系統(tǒng)，包括所述的雙模式傳感器，還包括led光源、帶通濾光片、光纖耦合器和光纖光譜儀，各組件通過sma905接口光纖跳線相連，led光源發(fā)出的光依次經(jīng)帶通濾光片與光纖耦合器到達(dá)雙模式傳感器，雙模式傳感器捕獲sef信號(hào)，經(jīng)光纖耦合器后傳輸至光纖光譜儀。

17、本發(fā)明還提供了一種表面增強(qiáng)拉曼散射光譜的檢測(cè)系統(tǒng)，包括便攜式拉曼光譜儀和所述的雙模式傳感器，所述便攜式拉曼光譜儀出射激光通過空間光耦合的方式對(duì)準(zhǔn)至所述雙模式傳感器的錐形光纖未拉錐端端面。

18、本發(fā)明還提供了所述的雙模式傳感器在制備檢測(cè)mir-21的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

19、本發(fā)明還提供了所述的雙模式傳感器在制備診斷mir-21相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

20、本發(fā)明還提供了所述表面增強(qiáng)熒光光譜的檢測(cè)系統(tǒng)在非診斷目的的檢測(cè)mir-21中的應(yīng)用。

21、本發(fā)明還提供了所述表面增強(qiáng)拉曼散射光譜的檢測(cè)系統(tǒng)在非診斷目的的檢測(cè)mir-21中的應(yīng)用。

22、在檢測(cè)過程中，當(dāng)雙模式傳感器周圍不存在mir-21時(shí)，由于dna與cdna雜交形成雙鏈具有剛性，故熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離aunps，此時(shí)sef信號(hào)強(qiáng)sers弱；如圖2所示，當(dāng)雙模式傳感器周圍存在mir-21時(shí)，cdna捕獲mir-21并脫離捕獲探針，剩余單鏈dna上由于存在回文序列，故發(fā)生分子內(nèi)雜交，形成環(huán)莖結(jié)構(gòu)，此時(shí)熒光基團(tuán)靠近aunps，sef信號(hào)減弱sers增強(qiáng)。

23、本發(fā)明具有如下有益效果：

24、1.本發(fā)明的雙模式傳感器選用價(jià)格低廉的普通多模光纖，具有可大批量制備、成本低、制作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)；

25、2.本發(fā)明的雙模式傳感器的主體結(jié)構(gòu)為一根錐形光纖，體積非常小，刺入細(xì)胞后可保證細(xì)胞的正常存活；

26、3.本發(fā)明的錐形光纖能夠增加接收端與樣品作用面積，表面增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)與表面增強(qiáng)熒光信號(hào)收集效率高；

27、4.本發(fā)明的雙模式傳感器可以結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼散射光譜和表面增強(qiáng)熒光光譜進(jìn)行對(duì)比分析，避免了單一方法檢測(cè)受背景干擾的問題，使定性檢測(cè)的結(jié)果更加準(zhǔn)確，進(jìn)一步使定量檢測(cè)的靈敏度和精度更高；

28、5.本發(fā)明所使用的mir-21探針確保了極高的特異性，若需要檢測(cè)其他特定mirna僅需更換捕獲探針即可，進(jìn)一步確保了本發(fā)明的泛用性。