本發(fā)明涉及環(huán)境分析和生物檢測(cè)，具體涉及一種基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和金屬納米簇檢測(cè)鎘離子的電化學(xué)方法。

背景技術(shù)：

1、鎘是一種有毒重金屬元素，在冶金、電鍍、電池、顏料等工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用，導(dǎo)致鎘通過(guò)多種途徑釋放到環(huán)境中，造成水體、土壤、空氣等的污染。鎘通過(guò)飲用水、食物鏈等方式進(jìn)入人體，在體內(nèi)積累，鎘離子可與蛋白質(zhì)、核酸等生物分子結(jié)合，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重?fù)p害，如導(dǎo)致腎功能損傷、免疫系統(tǒng)病變、神經(jīng)功能損傷、癌癥等。目前，鎘已被列為1級(jí)致癌物，世界各國(guó)均對(duì)水和食品中鎘的含量，做了嚴(yán)格的限制。目前常用檢測(cè)鎘和鎘離子的方法有原子吸收光譜、電感耦合等離子體發(fā)射光譜、電感耦合等離子體質(zhì)譜、原子熒光光譜等。然而，這些方法普遍存在一些局限，如儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)人員等，且不適用于實(shí)施現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。電化學(xué)傳感器具有簡(jiǎn)單、快速、成本低、準(zhǔn)確度和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，成為檢測(cè)鎘離子的理想和替代方法。

2、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hcr）作為一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，因其無(wú)酶、高效、成本低、結(jié)構(gòu)靈活等諸多優(yōu)勢(shì)，已成為一種強(qiáng)大的分子工具，被廣泛應(yīng)用于熒光、比色、電化學(xué)等檢測(cè)方法。銀納米簇（agncs）是一種新型納米材料，因其制備簡(jiǎn)單，導(dǎo)電性好，催化活性高等特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)診斷和治療、化學(xué)傳感器、熒光分析等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3、目前，缺乏一種實(shí)現(xiàn)對(duì)鎘離子快速、準(zhǔn)確和靈敏檢測(cè)的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和銀納米簇的電化學(xué)分析方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高和選擇性好的基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和金屬納米簇檢測(cè)鎘離子的電化學(xué)方法。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：第一方面，本發(fā)明提供了一種基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和金屬納米簇檢測(cè)鎘離子的電化學(xué)方法；第二方面，本發(fā)明提供了基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和金屬納米簇檢測(cè)鎘離子的電化學(xué)方法制得的電化學(xué)生物傳感器。

3、本發(fā)明的一種基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和金屬納米簇檢測(cè)鎘離子的電化學(xué)方法，包括如下步驟：（1）設(shè)計(jì)單鏈dna?s1序列：?jiǎn)捂渄na?s1具有seq?id?no.1所示的核苷酸序列；

4、（2）設(shè)計(jì)單鏈dna?s2序列：?jiǎn)捂渄na?s2具有seq?id?no.2所示的核苷酸序列；

5、（3）設(shè)計(jì)單鏈dna?s3序列：?jiǎn)捂渄na?s3具有seq?id?no.3所示的核苷酸序列；

6、（4）設(shè)計(jì)發(fā)夾dna?hp1序列：發(fā)夾dna?hp1具有seq?id?no.4所示的核苷酸序列；

7、（5）設(shè)計(jì)發(fā)夾dna?hp2序列：發(fā)夾dna?hp2具有seq?id?no.5所示的核苷酸序列；

8、（6）構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器：預(yù)處理工作電極，金電極經(jīng)piranha溶液浸泡、al2o3粉打磨拋光、h2so4溶液電化學(xué)活化，超聲清洗，吹干備用；單鏈dna?s3通過(guò)au-s鏈自組裝于金電極表面；單鏈dna?s1和單鏈dna?s2混合，95?℃熱處理5?min，自然冷卻至室溫，單鏈dnas1和單鏈dna?s2雜交形成雙鏈dna；加入cd2+，37?℃孵育40?min，雙鏈dna解體并釋放出單鏈dna?s1；釋放的單鏈dna?s1與金電極表面修飾的單鏈dnas3雜交形成新的雙鏈dna，并引發(fā)發(fā)夾dna?hp1、發(fā)夾dna?hp2在電極表面發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，形成hp1-hp2聚合體；hp1-hp2聚合體作為dna模板合成銀納米簇（agncs）產(chǎn)生信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)對(duì)cd2+的定量檢測(cè)；

9、（7）電化學(xué)定量測(cè)定；

10、（8）實(shí)際樣品測(cè)定。

11、進(jìn)一步地，在步驟（1）中，單鏈dna?s1的長(zhǎng)度為31個(gè)堿基；在步驟（2）中，單鏈dnas2的長(zhǎng)度為33個(gè)堿基；在步驟（3）中，單鏈dna?s3的長(zhǎng)度為22個(gè)堿基，5￠端標(biāo)記羥基；在步驟（4）中，發(fā)夾dna?hp1的長(zhǎng)度為38個(gè)堿基；在步驟（5）中，發(fā)夾dna?hp2的長(zhǎng)度為38個(gè)堿基。

12、更進(jìn)一步地，在步驟（6）中，在預(yù)處理好的金電極表面滴涂5?μl?2?μm?單鏈dna?s3溶液，30?℃孵育12?h，再滴涂5?μl?1?mm?6-巰基-1-己醇，室溫下孵育30?min，pbs緩沖液沖洗電極表面；將10?μl?2?μm?單鏈dna?s1和10?μl?2?μm?單鏈dna?s2混合，95?℃熱處理5min，自然冷卻至室溫，單鏈dna?s1和單鏈dna?s2雜交形成雙鏈dna；加入cd2+，37?℃孵育40min，雙鏈dna解體并釋放s1；移取hp1（1?μm）和hp2（1?μm）混合液滴涂于電極表面，37?℃孵育2?h，進(jìn)行雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；在修飾電極表面滴加5?μl?agno3（100?μm）和?檸檬酸鈉（20?mm）混合液，避光反應(yīng)20?min，再滴加5?μl?500?μm?nabh4，避光反應(yīng)20?min，pbs緩沖液沖洗，制得鎘離子電化學(xué)生物傳感器。

13、進(jìn)一步地，在步驟（6）中，單鏈dna?s3的用量和濃度分別為5?μl和2?μm，孵育溫度和時(shí)間分別為30?℃和12?h；6-巰基-1-己醇的用量和濃度分別為5?μl和1?mm，孵育溫度和時(shí)間分別為室溫和30?min；單鏈dna?s1的用量和濃度分別為10?μl和2?μm，單鏈dna?s2的用量和濃度分別為10?μl和2?μm，熱處理溫度和時(shí)間分別為95?℃和5?min；加入cd2+后，孵育溫度和時(shí)間分別為37?℃和40?min；發(fā)夾dna?hp1和發(fā)夾dna?hp2混合液的用量為2?μl，發(fā)夾dna?hp1和發(fā)夾dna?hp2濃度均為1?μm，孵育溫度和時(shí)間分別為37?℃和2?h；滴加agno3和檸檬酸鈉混合液的用量為5?μl，agno3和檸檬酸鈉濃度分別為100?μm和20?mm，滴加nabh4的用量和濃度分別為5?μl和500?μm，反應(yīng)條件為室溫避光20?min

14、進(jìn)一步地，在步驟（7）中，測(cè)定cd2+濃度：使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測(cè)試，采用微分脈沖伏安法dpv進(jìn)行定量，繪制dpv峰電流與cd2+濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

15、進(jìn)一步地，在步驟（8）中，實(shí)際樣品為昆明滇池和盤(pán)龍江水樣。

16、本發(fā)明基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和銀納米簇檢測(cè)重金屬鎘離子的電化學(xué)分析方法制得的電化學(xué)生物傳感器。

17、有益效果：本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、選擇性好。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

19、（1）本發(fā)明提供了一種電化學(xué)技術(shù)檢測(cè)重金屬鎘離子，本發(fā)明利用鎘離子（cd2+）和單鏈dna?s2之間特異性識(shí)別，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)提高了測(cè)定cd2+的選擇性；

20、（2）本發(fā)明利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在電極表面形成hp1-hp2聚合體產(chǎn)生信號(hào)放大，利用電極表面的雙鏈dna作為模板合成銀納米簇agncs進(jìn)一步放大信號(hào)，提高了測(cè)定cd2+的靈敏度；

21、（3）本發(fā)明制備的電化學(xué)生物傳感器可用于cd2+定量檢測(cè)；電化學(xué)放大響應(yīng)信號(hào)與cd2+濃度成正比，實(shí)現(xiàn)對(duì)cd2+的高靈敏度和高選擇性測(cè)定。

22、（4）本發(fā)明制備的電化學(xué)生物傳感器可用于實(shí)際環(huán)境水樣中cd2+的測(cè)定。