本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)，具體涉及一種光子免清洗總25-羥基維生素d全血測(cè)定試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、維生素d是人體必需的脂溶性維生素，其水平受很多因素的影響，主要包括紫外線輻射、膳食補(bǔ)充、年齡和肥胖、種族和民族因素等。維生素d主要有維生素d2和維生素d3兩種形式，其中維生素d3占人體總量的90％-95％。在紫外線的作用下，皮膚中的7－脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為前體維生素d3，然后在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為維生素d3，與維生素d結(jié)合蛋白(dbp)相結(jié)合，并被轉(zhuǎn)移到肝臟。與維生素d3不同，人體不能合成維生素d2，只能從食品中獲取。

2、維生素d本身不具有生物活性，需要發(fā)生2次羥基化轉(zhuǎn)化為生物活性形式。第1次羥基化發(fā)生在肝臟，產(chǎn)生25－羥基維生素d，第2次羥基化主要發(fā)生在腎臟，產(chǎn)生具有生物活性代謝物1，25－二羥維生素d。當(dāng)1，25－二羥維生素d足量時(shí)，它可進(jìn)一步在腎臟轉(zhuǎn)化為24，25-二羥維生素d，最后發(fā)生分解代謝。

3、維生素d與孕期婦女，女性在孕期如果維生素d缺乏，體內(nèi)缺鈣情況將更加嚴(yán)重。缺鈣會(huì)造成孕婦、哺乳期婦女周身無(wú)力、小腿抽筋、腿酸軟、腰腿痛等表現(xiàn)。維生素d決定鈣的吸收，《中國(guó)國(guó)家處方集》、美國(guó)兒科學(xué)會(huì)、中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)和《維生素d缺乏性佝僂病防治建議》等均推薦：妊娠期的婦女宜補(bǔ)充維生素d。維生素d與兒童，這一時(shí)期，為了滿足骨骼急速生長(zhǎng)發(fā)育的需要，身體對(duì)鈣的需求量急劇增加，而維生素d決定了鈣的吸收，所以，此階段的青少年兒童，應(yīng)補(bǔ)充維生素d，助力骨骼生長(zhǎng)，同時(shí)緩解多汗、盜汗、生長(zhǎng)痛等情況。2010年美國(guó)臨床內(nèi)分泌學(xué)家協(xié)會(huì)的臨床實(shí)踐醫(yī)學(xué)指南認(rèn)為，兒童和成年人預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，重要的是要確保其維生素d的充足。維生素d與中老年人，大約從45歲左右開始，晶狀體逐漸硬化、彈性下降，睫狀體的功能也在減弱，骨含量比高峰期時(shí)降低，當(dāng)骨含量低2—2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，就表明你被骨質(zhì)疏松纏上了，及時(shí)補(bǔ)充維生素d，保護(hù)骨骼健康。維生素d與骨骼健康，維生素d在鈣吸收、骨骼健康、肌肉性能、人體平衡和跌倒的風(fēng)險(xiǎn)中起主要作用。維生素d能增加腸道吸收鈣和磷酸鹽，促進(jìn)骨礦化，維生素d也對(duì)骨細(xì)胞有直接作用。因此，維生素d缺乏可導(dǎo)致骨礦化缺陷，會(huì)伴有骨質(zhì)疏松癥和骨折，造成佝僂病和骨軟化癥。

4、維生素d對(duì)心臟的也具有重要性，心臟病患者的血液中25-二羥維生素d的水平過(guò)低會(huì)導(dǎo)致心臟病(心肌梗死，心力衰竭)和高血壓的死亡率顯著上升。維生素d對(duì)精神的重要性，血液中vd含量與神經(jīng)系統(tǒng)的功能，如記憶力，邏輯分析能力，情緒，身體平衡能力等呈正相關(guān)關(guān)系，維生素d的降低與抑郁癥、帕金森綜合癥、癡呆病、強(qiáng)迫癥、精神分裂癥、自閉癥等多種神經(jīng)性疾病有密切關(guān)系。維生素d與癌癥相關(guān)性，大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，vd缺乏或不足(25-oh-vd<20ng/ml時(shí))，十幾種癌癥的幾率可能上升。且vd的缺乏也可能與癌癥的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有關(guān)，主要包括乳腺癌，前列腺癌等，維生素d含量低會(huì)加重乳腺癌的進(jìn)展。

5、據(jù)估測(cè)全世界有十億人存在維生素d缺乏或不足，40-100％的老人存在維生素d缺乏。50％絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女藥物治療時(shí)存在維生素d不足。隨著新的檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展及人類對(duì)健康的關(guān)注，維生素d的作用機(jī)制及臨床表現(xiàn)也越來(lái)越被重視。因此及時(shí)了解人體的維生素d的狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)維生素d的個(gè)體化補(bǔ)充具有重要的意義。

6、目前市場(chǎng)上常用的檢測(cè)方法主要有熒光層析法，免疫比濁法、磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法。熒光層析法，免疫比濁法普通存在的缺陷是重復(fù)性差、靈敏度低。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法雖然靈敏度有所改善，但測(cè)試繁瑣，需要幾次清洗步驟，測(cè)試等待時(shí)間較長(zhǎng)，一次標(biāo)本檢測(cè)需要40-60分鐘，且不能實(shí)現(xiàn)全血測(cè)試，中小級(jí)醫(yī)院很難普及。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為此，本發(fā)明提供一種光子免清洗總25-羥基維生素d全血測(cè)定試劑盒及其制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中現(xiàn)有技術(shù)中存在的靈敏度低、無(wú)法實(shí)現(xiàn)全血檢測(cè)、操作流程復(fù)雜、自動(dòng)化程度低以及本底效應(yīng)高等問(wèn)題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種光子免清洗總25-羥基維生素d全血測(cè)定試劑盒，包括水解稀釋劑r1、磁珠抗細(xì)胞試劑r2、還原保護(hù)劑r3、發(fā)光抗原試劑r4、檢測(cè)抗體試劑r5、磁珠包被試劑r6、變性試劑r7和酶促發(fā)光劑r8，其體積比例為(0.02-10)：(0.05-12)：(0.05-12)：(0.05-12)：(0.05-12)：(0.1-15)：(0.1-15)：(0.1-15)。

4、進(jìn)一步地，

5、所述水解稀釋劑r1包含：4-羥乙基哌嗪乙磺酸0.05-3wt％、氫氧化鈉0.01-1.5wt％、水解稀釋劑0.02-1.8wt％和乙二胺四乙酸二鈉0.04-2.8wt％；

6、所述磁珠抗細(xì)胞試劑r2為羧基磁珠-抗細(xì)胞抗體0.01-3wt％、酶分離劑0.01-2wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l；

7、所述還原保護(hù)劑r3為s聚乙二醇單辛基苯基醚0.05-1.5wt％、吐溫60為0.01-0.5wt％、乳化劑t-80為0.01-1.3wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l；

8、所述發(fā)光抗原試劑r4為25-羥基維生素d抗原-過(guò)氧化物酶復(fù)合物0.08-6.5wt％、增強(qiáng)劑0.01-6.3wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l；

9、所述檢測(cè)抗體試劑r5為親合素化的25-羥基維生素d單克隆抗體-親水吖啶酯復(fù)合物0.04-5.5wt％、增強(qiáng)劑0.01-5.6wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l；

10、所述磁珠包被試劑r6為鏈霉親和素包被的磁珠液試劑0.03-8.5wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l；

11、所述變性試劑r7為變性試劑0.05-5wt％、氨水溶液0.15-18wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l；

12、所述酶促發(fā)光試劑r8為促發(fā)劑0.5-20wt％、增強(qiáng)劑0.1-28wt％、tris緩沖液0.03-1.5mol/l、醋酸溶液0.02-12wt％。

13、進(jìn)一步地，

14、所述水解稀釋劑r1與樣本的體積比例為(0.05-25)：(0.07-32)；

15、所述磁珠抗細(xì)胞試劑r2與樣本的體積比例為(0.03-32)：(0.01-20)；

16、所述還原保護(hù)劑r3與樣本的體積比例為(0.05-21)：(0.01-24)；

17、所述發(fā)光抗原試劑r4與樣本的體積比例為(0.15-28)：(0.12-30)；

18、所述檢測(cè)抗體試劑r5與樣本的體積比例為(0.03-22)：(0.01-24)；

19、所述磁珠包被試劑r6與檢測(cè)抗體試劑r5的體積比例為(0.02-36)：(0.15-32)；

20、所述變性試劑r7與磁珠包被試劑r6的體積比例為(0.13-26)：(0.21-36)；

21、所述酶促發(fā)光劑試劑r8與變性試劑r7的體積比例為(0.11-27)：(0.21-33)。

22、進(jìn)一步地，所述光子免清洗總25-羥基維生素d全血測(cè)定試劑盒還包括校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。

23、進(jìn)一步地，所述磁珠分別為1-5μm的羧基基磁珠、1-5μm的甲苯磺?；胖椤?/p>

24、根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了上述的光子免清洗總25-羥基維生素d全血測(cè)定試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

25、s1.水解稀釋劑r1的制備：配制包含4-羥乙基哌嗪乙磺酸0.05-3wt％、氫氧化鈉0.01-1.5wt％、水解稀釋劑0.02-1.8wt％和乙二胺四乙酸二鈉0.04-2.8wt％的溶液；

26、s2.磁珠抗細(xì)胞試劑r2的制備：配制包含羧基磁珠-抗細(xì)胞抗體0.01-3wt％、酶分離劑0.01-2wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l的溶液；

27、s3.還原保護(hù)劑r3的制備：配制包含s聚乙二醇單辛基苯基醚0.05-1.5wt％、吐溫60為0.01-0.5wt％、乳化劑t-80為0.01-1.3wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l的溶液；

28、s4.發(fā)光抗原試劑r4的制備：配制包含25-羥基維生素d抗原-過(guò)氧化物酶復(fù)合物0.08-6.5wt％、增強(qiáng)劑0.01-6.3wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l的溶液；

29、s5.檢測(cè)抗體試劑r5的制備：配制包含親合素化的25-羥基維生素d單克隆抗體-親水吖啶酯復(fù)合物0.04-5.5wt％、增強(qiáng)劑0.01-5.6wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l的溶液；

30、s6.磁珠包被試劑r6的制備：配制包含鏈霉親和素包被的磁珠液試劑0.03-8.5wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l的溶液；

31、s7.變性試劑r7的制備：配制包含變性試劑0.05-5wt％、氨水溶液0.15-18wt％和tris緩沖液0.03-1.5mol/l的溶液；

32、s8.酶促發(fā)光劑r8的制備：配制包含促發(fā)劑0.5-20wt％、增強(qiáng)劑0.1-28wt％、tris緩沖液0.03-1.5mol/l、醋酸溶液0.02-12wt％的溶液。

33、進(jìn)一步地，所述磁珠包被試劑r2的制備具體包括：

34、s21.磁珠活化；

35、s22.加入偶聯(lián)劑，混勻，溫育后離心；

36、s23.抗細(xì)胞抗體加入緩沖液過(guò)純化柱；

37、s24.抗細(xì)胞抗體過(guò)透析膜，濃縮；

38、s25.步驟s24中的濃縮抗細(xì)胞抗體加入到步驟s22中，溫育，混勻后離心，棄上清加入緩沖液；

39、s26.加入封閉液混勻偶聯(lián)，4h后離心，棄上清加入保存液懸??；

40、s27.棄上清加入保存液懸浮儲(chǔ)存。

41、進(jìn)一步地，所述發(fā)光抗原試劑r4的制備具體包括：

42、s41.過(guò)氧化物酶活化、離心棄上清，用緩沖液重復(fù)清洗；

43、s42.加入偶聯(lián)劑溫育后離心，棄上清；

44、s43.總25-羥基維生素d抗原加入緩沖液過(guò)純化柱；

45、s44.總25-羥基維生素d抗原過(guò)透析膜，濃縮；

46、s45.向步驟s42中加入步驟s44中的總25-羥基維生素d抗原，混勻，溫育，離心，棄上清加入稀釋液；

47、s46.加入封閉液混勻，清洗離心；

48、s47.棄上清加入保存液保存。

49、進(jìn)一步地，所述檢測(cè)抗體試劑r5的制備具體包括：

50、s51.親水吖啶酯活化、離心棄上清，用緩沖液重復(fù)清洗；

51、s52.加入偶聯(lián)劑溫育后離心，棄上清；

52、s53.總25-羥基維生素d單克隆抗體親合素化處理；

53、s54.總25-羥基維生素d單克隆抗體過(guò)透析膜，濃縮；

54、s55.向步驟s52中加入步驟s54中的總25-羥基維生素d單克隆抗體，混勻，溫育，離心，棄上清加入稀釋液；

55、s56.加入封閉液混勻，清洗離心；

56、s57.棄上清加入保存液保存。

57、進(jìn)一步地，所述磁珠包被試劑r6的制備具體包括：

58、s61.磁珠活化；

59、s62.加入偶聯(lián)劑，混勻，溫育后離心；

60、s63.鏈霉親和素加入緩沖液過(guò)純化柱；

61、s64.鏈霉親和素過(guò)透析膜，濃縮；

62、s65.步驟s64中的濃縮鏈霉親和素加入到步驟s62中，溫育，混勻后離心，棄上清加入緩沖液；

63、s66.加入封閉液混勻偶聯(lián)，4h后離心，棄上清加入保存液懸??；

64、s67.棄上清加入保存液懸浮儲(chǔ)存。

65、本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

66、1.本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化試劑配方和測(cè)試流程，顯著提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。通過(guò)八種試劑巧妙的銜接，形成了空間串聯(lián)效應(yīng)，使試劑盒的最低檢測(cè)限可以達(dá)到0.025ng/ml，這比現(xiàn)有技術(shù)中的靈敏度提高了近40倍；通過(guò)使用高質(zhì)量的抗體和抗原復(fù)合物，如親合素化的25-羥基維生素d單克隆抗體-親水吖啶酯復(fù)合物和25-羥基維生素d抗原-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，增強(qiáng)了信號(hào)檢測(cè)的能力，有效地降低了本底效應(yīng)，進(jìn)一步提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

67、2.本發(fā)明提供的試劑盒能夠有效分離全血樣本中的干擾物，實(shí)現(xiàn)了全血樣本(包括指尖血)的準(zhǔn)確檢測(cè)；并且本發(fā)明提供的試劑盒采用了免清洗的設(shè)計(jì)，大大簡(jiǎn)化了操作流程，提高了檢測(cè)的速度和效率。一次標(biāo)本檢測(cè)僅需10分鐘，非常適合大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用，提高了自動(dòng)化程度，降低了對(duì)操作人員的專業(yè)技能要求。