本發(fā)明屬于藥物檢測，具體涉及一種靶向pcsk9基因的寡核苷酸藥物的中間體雜質(zhì)檢測方法。

背景技術(shù)：

1、近年來，治療用寡核苷酸作為一種可能治療多種疾病的藥物模式，越來越受到市場的關(guān)注，批準(zhǔn)的治療最初僅限于治療罕見疾病。然而，隨著靶向pcsk9基因的英克司蘭鈉注射液被批準(zhǔn)用于動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病患者的降膽固醇治療后，該類寡核苷酸藥物的研發(fā)和生產(chǎn)工作受到越來越多相關(guān)企業(yè)的重視。

2、目前寡核苷酸藥物主要使用固相磷酸酰胺化學(xué)法進(jìn)行合成，其過程包括迭代偶聯(lián)、蓋帽、氧化和脫保護(hù)步驟，從而延長核苷酸序列。然而，由于各步驟反應(yīng)效率均無法達(dá)到100%，這使得中間體和成品中會(huì)含有較多序列相關(guān)雜質(zhì)。序列相關(guān)雜質(zhì)的存在使得寡核苷酸藥物在使用過程中具有一定的安全性風(fēng)險(xiǎn)，為了提高使用安全性，需要對(duì)合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)進(jìn)行鑒定和分離。

3、質(zhì)譜和液相色譜在寡核苷酸藥物質(zhì)量研究方面的引入，為治療性寡核苷酸藥物的快速臨床應(yīng)用提供了技術(shù)基礎(chǔ)。理論上來看，通過液相色譜對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行分離，再通過質(zhì)譜分析相應(yīng)的雜質(zhì)，不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)成品的質(zhì)量控制，并能快速指導(dǎo)工藝優(yōu)化，節(jié)約成本投入。然而，實(shí)際生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，液相色譜和質(zhì)譜的聯(lián)用方案在寡核苷酸藥物及其中間體的鑒定和純化中應(yīng)用仍存在諸多問題和限制。

4、例如：

5、quality?aspects?of?oligonucleotide?drug?development:srecificationsfor?active?pharmaceutical?ingredients[j]。drug?information?journal,?2012,?46(5):611-626提出了可以分別利用質(zhì)譜和液相色譜進(jìn)行寡核苷酸的鑒別和純度檢測，但在液相色譜中僅能使用保留時(shí)間作為鑒別的可靠方式，但由于寡核苷酸雜質(zhì)眾多，分離狀況欠佳，且僅依據(jù)單一的液相或質(zhì)譜的方式進(jìn)行序列鑒別并不足夠有力。

6、assay,?purity,?and?impurity?profile?of?phosphorothioateoligonucleotide?therapeutics?by?ion?pair–hplc–ms[j].nucleic?acidtherapeutics,?2022,?32(3):206-220建立了液質(zhì)連用的方法分析不同硫代寡核苷酸藥物有關(guān)物質(zhì)，但其提供的方法中，不完全硫代序列雜質(zhì)(p=o)1未分離，只能通過eic提取離子流進(jìn)行含量檢測，且未提出鑒別寡核苷酸的方式。

7、cn118050441a公開了一種分離并鑒定寡核苷酸n及其n-1雜質(zhì)的方法，該方法使用陰離子交換色譜柱進(jìn)行了寡核苷酸n及其n-1雜質(zhì)的分離和鑒定，但其主要依賴于保留時(shí)間來進(jìn)行鑒定，且使用的流動(dòng)相為不揮發(fā)性鹽溶液，與質(zhì)譜兼容性差，無法聯(lián)用質(zhì)譜進(jìn)行雜質(zhì)鑒定。

8、因此，亟需開發(fā)重現(xiàn)性好、可以有效兼容質(zhì)譜儀的寡核苷酸藥物鑒別和純度分析方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種靶向pcsk9基因的寡核苷酸藥物的中間體雜質(zhì)檢測方法。

2、本發(fā)明提供的方法可同時(shí)鑒別和分離中間體中正義鏈和反義鏈的縮短序列雜質(zhì)、硫代不完全序列雜質(zhì)和增長序列雜質(zhì)，具有良好的除雜效果。而且，該方法在各批次間重現(xiàn)性良好，可用于中間體的質(zhì)量控制。

3、本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在采用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的方式對(duì)寡核苷酸類藥物或其中間體進(jìn)行雜質(zhì)分離（又可稱為“除雜”）和純度鑒定時(shí)，液相色譜的流動(dòng)相選擇十分重要。一方面，不同的流動(dòng)相對(duì)于寡核苷酸的分離具有不同的效果，尤其是流動(dòng)相中離子的選擇和用量的調(diào)整，對(duì)試劑的組成種類和濃度的調(diào)整等，可以影響雜質(zhì)和主成分的分離情況；另一方面，液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)需要色譜選用的流動(dòng)相具有良好的可揮發(fā)性，若使用揮發(fā)性差的流動(dòng)相添加劑，揮發(fā)后殘留的鹽會(huì)導(dǎo)致質(zhì)譜儀堵塞及損壞。

4、基于此，本發(fā)明提供一種靶向pcsk9基因的寡核苷酸藥物的中間體雜質(zhì)檢測方法，其包括采用高效液相色譜對(duì)含有所述寡核苷酸藥物中間體的供試溶液進(jìn)行雜質(zhì)分離和檢測，其中，液相色譜的條件包括：

5、采用的色譜柱選自固定相采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；以及

6、流動(dòng)相a選自1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇和正己胺的水溶液；

7、流動(dòng)相b選自甲醇和乙腈的混合溶液；

8、所述寡核苷酸藥物包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈的核苷酸序列如seq?id?no:7所示，所述反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no:8所示；

9、所述雜質(zhì)包括核苷酸序列如seq?id?no:1-6所示的序列雜質(zhì)中的一種或多種。

10、本發(fā)明中，“雜質(zhì)”主要指核苷酸序列雜質(zhì)（又可稱為“序列雜質(zhì)”），即與目標(biāo)寡核苷酸序列不同（包括核苷酸序列的長度、核苷酸種類和排布等不同，也包括核苷酸序列上的修飾不同）的其他寡核苷酸序列。

11、采用本發(fā)明提供的方法可以檢出選自以下中的任意一種或多種雜質(zhì)：

12、寡核苷酸藥物中間體的縮短序列雜質(zhì)、增長序列雜質(zhì)和硫代不完全雜質(zhì)；

13、其中，所述縮短序列雜質(zhì)包括在正義鏈和/或反義鏈的序列上缺失至少1個(gè)堿基的寡核苷酸序列；

14、所述增長序列雜質(zhì)包括在正義鏈和/或反義鏈的序列上增加至少1個(gè)堿基的寡核苷酸序列；

15、所述硫代不完全序列雜質(zhì)包括在正義鏈和/或反義鏈的序列上至少1個(gè)目標(biāo)堿基沒有被硫代修飾的寡核苷酸序列。

16、本發(fā)明中，縮短序列雜質(zhì)對(duì)于核苷酸缺失的具體位置沒有特別限制，只要與目標(biāo)寡核苷酸序列相比，在寡核苷酸序列（無論正義鏈還是反義鏈）中缺失了至少一個(gè)核苷酸即為所述縮短序列雜質(zhì)。本發(fā)明中，增長序列雜質(zhì)對(duì)于核苷酸增加的位置沒有特別限制，只要與目標(biāo)寡核苷酸序列相比，在寡核苷酸序列（無論正義鏈還是反義鏈）中增加了至少一個(gè)核苷酸即為所述增長序列雜質(zhì)。本發(fā)明中，硫代不完全序列雜質(zhì)對(duì)于目標(biāo)堿基未被硫代修飾的位置也沒有特別限制，只要與目標(biāo)寡核苷酸序列相比，在寡核苷酸序列（無論正義鏈還是反義鏈）中應(yīng)當(dāng)為具有硫代修飾的核苷酸位點(diǎn)未進(jìn)行修飾，或是進(jìn)行了其他類別的修飾，均可視為所述硫代不完全序列雜質(zhì)。

17、例如，縮短序列雜質(zhì)可以為相對(duì)于目標(biāo)正義鏈（seq?id?no:7）而言，缺失其中任意1-20個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列。例如核苷酸的缺失量可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)，或者也可以為上述任意兩個(gè)值構(gòu)成的范圍，或是該范圍中的任意中間值。

18、例如，縮短序列雜質(zhì)可以為相對(duì)于目標(biāo)反義鏈（seq?id?no:8）而言，缺失其中任意1-22個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列。例如核苷酸的缺失量可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個(gè)，或者也可以為上述任意兩個(gè)值構(gòu)成的范圍，或是該范圍中的任意中間值。

19、例如，增長序列雜質(zhì)可以為相對(duì)于正義鏈（seq?id?no:7）或是反義鏈（seq?id?no:8），在其序列中的任意位置增加至少一個(gè)核苷酸所得到的寡核苷酸序列。例如增加的核苷酸數(shù)量可以為1-100個(gè)，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80、90、100個(gè)，或者也可以為上述任意兩個(gè)值構(gòu)成的范圍，或是該范圍中的任意中間值。

20、優(yōu)選地，所述硫代不完全序列雜質(zhì)包括在正義鏈的序列上2個(gè)目標(biāo)堿基（即正義鏈5’→3’的第一位g和第二位a）中的其中至少1個(gè)沒有被硫代修飾的寡核苷酸序列。例如可以為正義鏈5’→3’的第一位g未被硫代修飾、第二位a未被硫代修飾，或是第一位g和第二位a均未被硫代修飾。

21、優(yōu)選地，所述硫代不完全序列雜質(zhì)包括在反義鏈的序列上4個(gè)目標(biāo)堿基（即反義鏈5’→3’的第二位a、第三位a、第二十二位a和第二十三位a）中至少1個(gè)沒有被硫代修飾的寡核苷酸序列。例如可以為反義鏈5’→3’的第二位a、第三位a、第二十二位a和第二十三位a中的任意1個(gè)、任意2個(gè)或任意3個(gè)未被硫代修飾，或是上述四個(gè)位點(diǎn)均未被硫代修飾。

22、應(yīng)當(dāng)注意的是，以上針對(duì)硫代不完全雜質(zhì)的說明中，“未被硫代修飾”是指目標(biāo)序列中本應(yīng)當(dāng)進(jìn)行硫代修飾的位點(diǎn)沒有進(jìn)行硫代修飾，其既可以包括該位點(diǎn)沒有進(jìn)行任何修飾，也可以包括該位點(diǎn)進(jìn)行了硫代修飾之外的其他任意類型的修飾。

23、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案，其中，所述雜質(zhì)包括seq?id?no:1-6中的至少一種所示的序列。需要說明的是，seq?id?no:1-6中僅為示例性的列出了幾種與目標(biāo)正義鏈序列或目標(biāo)反義鏈序列結(jié)構(gòu)十分接近，從而較難與目標(biāo)序列分離的雜質(zhì)序列（例如利用現(xiàn)有技術(shù)中的方法無法將這些雜質(zhì)序列與目標(biāo)序列分離）。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠理解到，在本發(fā)明提供的方法可以去除核苷酸序列如seq?id?no:1-6中任一項(xiàng)所述的雜質(zhì)序列的情況下，該方法對(duì)于具有其他結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)序列應(yīng)當(dāng)也能夠去除，且可以得到與這些雜質(zhì)序列至少相當(dāng)?shù)娜コЧ?/p>

24、本發(fā)明提供的方法中所涉及的寡核苷酸藥物中間體以及雜質(zhì)至少包括如下寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)信息表中所列舉的寡核苷酸序列。下表中：

25、標(biāo)“_”的位置代表缺失1個(gè)堿基；

26、通過以下化學(xué)符號(hào)描述：

27、c=胞嘧啶，u=尿嘧啶，a=腺嘌呤，g=鳥嘌呤；m=2’-o-甲基修飾的糖，f=2’-f修飾的糖；evp=乙烯基磷酸酯鍵，s=硫代磷酸酯核苷間鍵；

28、g5=[[（1r，2r，3r，4r）-1-[[28-[[2-（乙酰氨基）-2-脫氧-β-d-吡喃半乳糖基]氧基]-13,13-雙[[3-[[3-[[5-[[2-（乙酰氨基）-2-脫氧-β-d-吡喃半乳糖基]氧基]-1-氧代戊基]氨基]丙基]氨基]-3-氧代丙氧基]甲基]-11,18,24-三氧代-15-氧雜-12,19,23-三氮雜二十八烷-1-基]氧基]-2-甲氧基-5-β-d-呋喃核糖基]磷酸氫。

29、

30、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，所述雜質(zhì)為核苷酸序列如seq?id?no:1-6所示的序列雜質(zhì)的混合物。

31、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，流動(dòng)相a中，1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的濃度為100-300mmol/l；正己胺的濃度為10-30mmol/l。

32、例如，流動(dòng)相a中，1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的濃度可以為100mmol/l、120mmol/l、140mmol/l、160mmol/l、180mmol/l、200mmol/l、220mmol/l、240mmol/l、260mmol/l、280mmol/l、300mmol/l，或者也可以為上述任意兩個(gè)值構(gòu)成的范圍，或是該范圍中的任意中間值。

33、例如，流動(dòng)相a中，正己胺的濃度可以為10mmol/l、12mmol/l、14mmol/l、16mmol/l、18mmol/l、20mmol/l、22mmol/l、24mmol/l、26mmol/l、28mmol/l、30mmol/l，或者也可以為上述任意兩個(gè)值構(gòu)成的范圍，或是該范圍中的任意中間值。

34、優(yōu)選地，流動(dòng)相a中，1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的濃度為200?mmol/l。

35、優(yōu)選地，流動(dòng)相a中，正己胺的濃度為25mmol/l。

36、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，流動(dòng)相b中，甲醇和乙腈的體積比為1:1。

37、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，色譜柱的填充劑粒徑為1.7-2.7μm。

38、例如，色譜柱的填充劑粒徑可以為1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm，或者也可以為上述任意兩個(gè)值構(gòu)成的范圍，或是該范圍中的任意中間值。

39、優(yōu)選地，色譜柱的填充劑粒徑為1.7μm。

40、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，色譜柱的規(guī)格為2.1-4.6mm×50-150mm。

41、例如，色譜柱的規(guī)格可以為4.6mm×100mm、4.6mm×250mm和2.1mm×150mm中的任一種。

42、優(yōu)選地，色譜柱的規(guī)格為2.1mm×150mm。

43、在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述液相色譜條件中，洗脫梯度為：

44、

45、也即，所述液相色譜的洗脫梯度為：

46、0-20min時(shí)，?流動(dòng)相b體積從25%變化至50%；

47、20-22min時(shí)，流動(dòng)相b體積從50%變化至60%；

48、22-22.1min時(shí)，流動(dòng)相b體積從60%變化至25%；

49、22.1-27min時(shí)，流動(dòng)相b體積維持在25%。

50、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，所述供試溶液中，所述寡核苷酸藥物的濃度為0.1-1mg/ml。（即，正義鏈的濃度為0.1-1mg/ml，或者，反義鏈的濃度為0.1-1mg/ml）

51、例如，所述寡核苷酸藥物的濃度可以為0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml、0.65mg/ml、0.7mg/ml、0.75mg/ml、0.8mg/ml、0.85mg/ml、0.9mg/ml、0.95mg/ml、1mg/ml，或者也可以為上述任意兩個(gè)值構(gòu)成的范圍，或是該范圍中的任意中間值。

52、優(yōu)選地，所述供試溶液中，所述寡核苷酸藥物中間體的濃度為0.5-0.75mg/ml。

53、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，液相色譜條件還包括：柱溫為70℃。

54、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，液相色譜條件還包括：流速為0.27-0.33ml/min。例如可以為0.27?ml/min、0.28ml/min、0.29ml/min、0.3ml/min、0.31ml/min、0.32ml/min、0.33ml/min，或者也可以為上述任意兩個(gè)值構(gòu)成的范圍，或是該范圍中的任意中間值。

55、優(yōu)選地，流速為0.3?ml/min。

56、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，液相色譜條件還包括：檢測波長為258-262nm。例如可以為258nm、259nm、260nm、261nm、262nm，或者也可以為上述任意兩個(gè)值構(gòu)成的范圍，或是該范圍中的任意中間值。

57、優(yōu)選地，檢測波長為260nm。

58、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，液相色譜條件還包括：進(jìn)樣量為1-5μl。例如可以為1μl、2μl、3μl、4μl、5μl，或者也可以為上述任意兩個(gè)值構(gòu)成的范圍，或是該范圍中的任意中間值。

59、優(yōu)選地，進(jìn)樣量為2μl。

60、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸藥物中間體和雜質(zhì)的保留時(shí)間包括：

61、

62、其中，保留時(shí)間的相對(duì)偏差rd小于1%。

63、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，所述方法還包括配制供試溶液的步驟，其包括將所述寡核苷酸藥物與稀釋劑接觸。

64、本發(fā)明中，稀釋劑可以為任意可用于液相色譜中稀釋/溶解寡核苷酸藥物或其中間體的試劑。

65、優(yōu)選地，所述稀釋劑為水和/或甲醇。也即，稀釋劑可以為水（例如去離子水、超純水等）、甲醇，或是甲醇的水溶液。

66、更優(yōu)選地，所述甲醇的水溶液中，甲醇的含量為5-15體積%。例如可以為5體積%、6體積%、7體積%、8體積%、9體積%、10體積%、11體積%、12體積%、13體積%、14體積%、15體積%，或者也可以為上述任意兩個(gè)值構(gòu)成的范圍，或是該范圍中的任意中間值。

67、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案，其中，稀釋劑為水。

68、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案，其中，所述方法還包括采用質(zhì)譜對(duì)液相色譜得到的產(chǎn)物進(jìn)行純度檢測的步驟。

69、優(yōu)選地，質(zhì)譜的條件包括：離子源為電噴霧離子源。

70、優(yōu)選地，質(zhì)譜的條件包括：采集極性為負(fù)極性模式。

71、優(yōu)選地，質(zhì)譜的條件包括：采集范圍為m/z=600-3000。

72、優(yōu)選地，質(zhì)譜的條件包括：毛細(xì)管電壓為3.0kv。

73、優(yōu)選地，質(zhì)譜的條件包括：干燥氣體溫度為350℃。

74、本發(fā)明所取得的有益效果至少包括：

75、本發(fā)明提供了一種可同時(shí)鑒別和分離目標(biāo)寡核苷酸中間體正義鏈和正義鏈雜質(zhì)1（縮短序列5’n-1），雜質(zhì)2（硫代不完全序列雜質(zhì)）、雜質(zhì)3（增長序列雜質(zhì)5’n+gms），以及目標(biāo)反義鏈和反義鏈雜質(zhì)4（縮短序列雜質(zhì)5’n-1），雜質(zhì)5（硫代不完全序列雜質(zhì)）、雜質(zhì)6（增長序列雜質(zhì)5’n+afs）的方法。

76、其中，正義鏈中雜質(zhì)1（縮短序列5’n-1），雜質(zhì)2（硫代不完全序列雜質(zhì)）、雜質(zhì)3（增長序列雜質(zhì)5’n+gms）與主峰間峰谷比均＞1.00，峰形明顯，能實(shí)現(xiàn)正義鏈主峰與3種雜質(zhì)的分離。

77、反義鏈中除雜質(zhì)5（硫代不完全序列雜質(zhì)）外，雜質(zhì)4（縮短序列5’n-1），、雜質(zhì)6（增長序列雜質(zhì)5’n+afs）與主峰間峰谷比均＞1.00，峰形明顯，能實(shí)現(xiàn)反義鏈主峰與2種雜質(zhì)的分離。

78、在上述分離效果下，使用液相色譜聯(lián)用高分辨質(zhì)譜儀，進(jìn)行正義鏈和反義鏈中間體的鑒別檢測，根據(jù)正義鏈和反義鏈的指紋圖譜中各峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，識(shí)別了相應(yīng)雜質(zhì)峰的分子量，并推測了其堿基缺失情況，基于序列的唯一性，通過分子量的差異，有效實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)寡核苷酸序列的鑒別。

79、此外，本發(fā)明提供的方法中通過甄選液相色譜選用的色譜柱和流動(dòng)相，使得液相色譜分離得到的產(chǎn)物可以繼續(xù)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，進(jìn)一步提高分離產(chǎn)物的純度鑒定精度和準(zhǔn)確性，檢測結(jié)果更加可信。