基于焦點調(diào)制的熒光顯微系統(tǒng)及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及光學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于焦點調(diào)制的熒光顯微系統(tǒng)及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在活體生物組織的熒光成像技術(shù)領(lǐng)域中，熒光顯微鏡(例如雙光子顯微鏡)已成為一種必不可少的成像工具，與單光子技術(shù)相比，它最重要的一個優(yōu)點是能夠?qū)裆锝M織樣品進行三維成像。由于對散射生物組織樣品具有亞細胞橫向分辨率，雙光子顯微鏡成為目前最受歡迎的顯微技術(shù)之一。但是，雙光子顯微鏡的縱向分辨率受光學(xué)成像限制較多，目前僅為2微米左右，無法縱向分辨更細微的生物組織樣品。
[0003]由于生物組織樣品對入射光具有吸收、散射作用，隨著探測深度的增加，激發(fā)光在焦點處的功率呈現(xiàn)指數(shù)衰減，信號減弱，在非焦點處的噪聲增強，這使得成像信噪比(即焦點處的信號與非焦點處的噪聲的比值)變差。經(jīng)過某一特定探測深度后，噪聲強度最終超過信號強度，此時再無法分辨信號和噪聲，這個探測深度即為成像系統(tǒng)的極限成像深度。從這個角度講，提高成像信噪比將是增加成像深度的關(guān)鍵。
[0004]最近，出現(xiàn)了一些焦點調(diào)制技術(shù)，用于增加顯微系統(tǒng)的分辨率和成像深度。其中一種是雙光束焦點調(diào)制技術(shù)(Opt.Express, 16(2008) 18764)，被用于共聚焦顯微系統(tǒng)上，該技術(shù)調(diào)制兩D型光束的相對相位使其在物鏡焦點處形成干涉，并通過提取焦點處與調(diào)制信號同相的信號作為焦點信號，以增加顯微系統(tǒng)的分辨率和成像深度；另一種是脈沖時間聚焦調(diào)制技術(shù)(Proc.0f SPIE, 8588(2013)858824)，該技術(shù)通過色散介質(zhì)使脈沖光發(fā)生空間色散，使得僅在物鏡的焦平面產(chǎn)生時間較短的脈沖光，而在焦平面的前部與后部得到時間展寬的脈沖，如此以來，入射光子只在焦平面處得到有效聚集，這使焦平面處的熒光強度達到最大。
[0005]盡管如此，現(xiàn)有技術(shù)對縱向分辨率的提高仍非常有限，到目前為止還沒有方法可通過做縱向焦點調(diào)制來提高縱向分辨率和增加成像深度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種基于焦點調(diào)制的熒光顯微系統(tǒng)及方法，該熒光顯微系統(tǒng)通過縱向焦點調(diào)制提高成像深度和信噪比，并進一步改善空間分辨率。
[0007]本發(fā)明實施例提供一種基于焦點調(diào)制的熒光顯微系統(tǒng)，所述熒光顯微系統(tǒng)包括光源組件、光路調(diào)制組件、聚光組件及光電檢測組件；其中，所述光源組件包含激光器，以產(chǎn)生照射至樣品目標區(qū)域的光束；所述光路調(diào)制組件將所述光束分離為非調(diào)制光束和待調(diào)制光束；所述聚光組件位于所述光路調(diào)制組件下游，從所述光路調(diào)制組件出射的所述非調(diào)制光束通過所述聚光組件形成的初始顯微光路后聚焦照射至所述樣品目標區(qū)域；所述光路調(diào)制組件為所述待調(diào)制光束提供一與該初始顯微光路共軛的一共軛光路，且所述光路調(diào)制組件能夠周期性調(diào)制所述共軛光路的共軛位置，所述待調(diào)制光束經(jīng)所述光路調(diào)制組件后形成調(diào)制光束，該調(diào)制光束進入所述初始顯微光路，所述調(diào)制光束和所述非調(diào)制光束在所述熒光顯微系統(tǒng)的成像物鏡焦點處發(fā)生干涉，通過周期性調(diào)制所述共軛光路的共軛位置而縱向調(diào)制照射至樣品目標區(qū)域的光束在所述成像物鏡焦點處的焦點；所述光電檢測組件接收所述樣品目標區(qū)域產(chǎn)生的光信號，并將所述光信號轉(zhuǎn)換為電信號。
[0008]一個實施例中，所述非調(diào)制光束經(jīng)過所述聚光組件聚焦得到第一焦點，所述調(diào)制光束經(jīng)過所述聚光組件聚焦得到第二焦點，所述第二焦點沿光軸方向在所述第一焦點前后來回掃動；以及所述光電檢測組件解調(diào)所述電信號以提取當所述第一焦點和所述第二焦點重合時的所述電信號。
[0009]一個實施例中，所述光路調(diào)制組件包括分光元件、第一反光元件和調(diào)制元件組；其中，所述分光元件將所述光束分離為所述非調(diào)制光束和所述待調(diào)制光束；所述第一反光元件用于使所述非調(diào)制光束直接進入所述初始顯微光路；所述調(diào)制元件組用于對所述待調(diào)制光束進行調(diào)制形成周期性變化的所述調(diào)制光束，并使其進入所述初始顯微光路；以及所述分光元件為分光片、光柵或三棱鏡，所述第一反光元件為反光鏡。
[0010]一個實施例中，所述調(diào)制元件組包括共軛物鏡、第二反光鏡和壓電陶瓷；其中，所述共軛物鏡用于聚焦所述待調(diào)制光束；所述第二反光鏡固定在沿所述共軛物鏡的光軸方向周期掃動的所述壓電陶瓷上，以反射調(diào)制后的所述待調(diào)制光束；以及所述調(diào)制光束經(jīng)所述第二反光鏡反射后，依次返回所述共軛物鏡和所述分光元件后進入所述初始顯微光路。
[0011]一個實施例中，所述壓電陶瓷在非工作狀態(tài)時，所述待調(diào)制光束經(jīng)所述共軛物鏡聚焦得到的第三焦點落在所述第二反光鏡上，所述第三焦點和所述第二焦點共軛，所述調(diào)制光束和非調(diào)制光束到達所述成像物鏡焦點位置的光程相等。
[0012]一個實施例中，所述聚光組件包括第三反光元件、第一聚焦透鏡、第二聚焦透鏡、二向色鏡以及所述成像物鏡；其中，所述非調(diào)制光束和所述調(diào)制光束分別經(jīng)過所述第三反光元件反射后，依次經(jīng)由所述第一聚焦透鏡和所述第二聚焦透鏡聚焦以被擴束，然后經(jīng)過所述二向色鏡進入所述成像物鏡聚焦；所述第三反光元件為二維掃描振鏡或可變形微反射鏡陣列；以及所述第一焦點位于所述成像物鏡的焦平面上。
[0013]一個實施例中，所述光電檢測組件包括第三聚焦透鏡、光電倍增管及鎖相放大器；其中，所述樣品目標區(qū)域產(chǎn)生的光信號經(jīng)過所述成像物鏡收集后，經(jīng)由所述二向色鏡入射至所述第三聚焦透鏡，所述光電倍增管接收通過所述第三聚焦透鏡聚焦的所述光信號并將其轉(zhuǎn)換為電信號，所述鎖相放大器解調(diào)所述電信號以提取所述第一焦點和所述第二焦點重合時的所述電信號。
[0014]本發(fā)明實施例還提供一種基于焦點調(diào)制的熒光顯微方法，適用于熒光顯微系統(tǒng)，所述熒光顯微方法包括步驟:通過分光鏡將照射至樣品目標區(qū)域的入射光束分為非調(diào)制光束和待調(diào)制光束，所述非調(diào)制光束依次經(jīng)過第一反光元件及所述分光鏡反射后直接入射至初始顯微光路；所述待調(diào)制光束入射至與所述初始顯微光路共軛的共軛光路，形成周期性變化的調(diào)制光束，之后進入所述初始顯微光路，入射到所述初始顯微光路的成像物鏡，且所述調(diào)制光束在所述成像物鏡的后向孔徑上的入射角周期性地變化，所述調(diào)制光束與所述非調(diào)制光束在所述成像物鏡焦點處發(fā)生干涉，所述調(diào)制光束的焦點和非調(diào)制光束的焦點在縱向方向上周期性的重合與分離，使得所述樣品目標區(qū)域產(chǎn)生熒光強度周期性變化的光信號；接收所述樣品目標區(qū)域產(chǎn)生的光信號，并將所述光信號轉(zhuǎn)換為電信號。
[0015]—個實施例中，在所述焚光顯微系統(tǒng)中，激光器產(chǎn)生所述入射光束；所述非調(diào)制光束和所述調(diào)制光束經(jīng)所述成像物鏡聚焦分別得到第一焦點和第二焦點，且所述第二焦點沿光軸方向在所述第一焦點前后來回掃動；通過光電倍增管接收所述樣品目標區(qū)域產(chǎn)生的光信號，并將所述光信號轉(zhuǎn)換為所述電信號，并通過鎖相放大器解調(diào)所述電信號以提取當所述第一焦點和所述第二焦點重合時的所述電信號。
[0016]一個實施例中，使所述第二焦點沿光軸方向在所述第一焦點前后來回掃動的步驟包括:使所述待調(diào)制光束由共軛物鏡聚焦得到的第三焦點落在第二反光鏡上；及使所述第二反光鏡隨壓電陶瓷沿所述第三焦點的光軸方向作周期掃動。
[0017]一個實施例中，所述壓電陶瓷在非工作狀態(tài)時，所述調(diào)制光束和所述非調(diào)制光束在所述熒光顯微系統(tǒng)中經(jīng)過的光程相等，且所述第三焦點與所述第二焦點共軛。
[0018]本發(fā)明實施例對熒光顯微