一種epo突變體的毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化學(xué)分析和藥物分析領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種毛細(xì)管電泳方法用于 測(cè)定達(dá)依泊汀α精細(xì)結(jié)構(gòu)，即確定構(gòu)成達(dá)依泊汀α糖組分的種類和含量。
【背景技術(shù)】
[0002] 促紅細(xì)胞生成素（EPO)是一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的糖蛋白激素，由腎臟細(xì)胞分泌。 由于慢性腎衰竭（CRF)發(fā)展過(guò)程中腎臟組織逐漸被破壞，EPO分泌不足是腎性貧血的主要 原因。自從上世紀(jì)80年代重組人促紅細(xì)胞生成素（rHuEPO)問(wèn)世以來(lái)，就成為腎性貧血的 主要治療手段，臨床上取得良好的治療效果。但其半衰期相對(duì)較短，通常需要每周給藥2 - 3次，給患者和醫(yī)護(hù)人員帶來(lái)不便，甚至有些患者因?yàn)榭謶肿⑸涠艞壷委煛?br>[0003] 達(dá)依泊汀a (darbepoetin alfa)是rHuEPO高糖基化的類似物，是通過(guò)重組DNA 技術(shù)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO)細(xì)胞內(nèi)合成的（參見(jiàn)CN94109128. 7)，已由美國(guó)Amgen公司開(kāi) 發(fā)上市，商品名Aranesp。達(dá)依泊汀α由5個(gè)N連接的糖基側(cè)鏈及22個(gè)唾液酸殘基組成， 比rHuEPO多2個(gè)N連接糖基側(cè)鏈和8個(gè)唾液酸殘基（圖1)。rHuEPO是一種單鏈的酸性糖 蛋白，含有165個(gè)氨基酸。EPO的糖基化修飾包括3個(gè)N末端糖鏈（分別位于天冬氨酸殘基 Asp24、Asp38和Asp83)和1個(gè)絲氨酸氧末端糖鏈（位于Serl26)，其主要成分是甘露糖、巖 藻糖和唾液酸等。而達(dá)依泊汀α通過(guò)定點(diǎn)突變的方式，改變了 rHuEPO原有的5個(gè)氨基酸 位點(diǎn)（Ala30Asn，His32Thr，Pro87Val，Trp88Asn 和 Pro90Thr)，在第 30 和第 88 位氨基酸位 置引入了兩個(gè)新的N-糖基化位點(diǎn)，但新位點(diǎn)的產(chǎn)生并不影響蛋白質(zhì)3級(jí)結(jié)構(gòu)和其與受體的 結(jié)合。達(dá)依泊汀α的分子量為37KD，比rHuEPO (30. 4KD)大，其糖基含量也由40 %增加到 52%。由于唾液酸殘基帶負(fù)電荷，因此本品所帶負(fù)電荷比rHuEPO多。
[0004] 達(dá)依泊汀α的生物作用機(jī)制與rHuEPO和天然EPO相似，與前體紅細(xì)胞膜上的EPO 受體結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，促使前體紅細(xì)胞增殖、分化、生存期延長(zhǎng)，從而使循環(huán) 中的紅細(xì)胞數(shù)量和容量增加。靜脈注射達(dá)依泊汀α的半衰期是rHuEPO的3倍（分別為 25. 3和8. 5小時(shí)），清除率顯著低于rHuEPO
[0005] 達(dá)依泊汀α的糖基化狀況直接影響其生物活性。糖蛋白中的寡糖存在微不均一 性，達(dá)依泊汀α的質(zhì)量控制關(guān)鍵在于寡糖分析。由于達(dá)依泊汀α所含的唾液酸較易脫 落，而唾液酸能降低達(dá)依泊汀α在體內(nèi)的代謝速度，因此需要能密切控制唾液酸組分即 糖組分的分析方法。
[0006] 理論上達(dá)依泊汀α具有22個(gè)唾液酸殘基，但是由于達(dá)依泊汀α所含的唾液酸較 易脫落，因此實(shí)際上在通過(guò)細(xì)胞表達(dá)得到的達(dá)依泊汀α是糖組分存在微不均一性的混合 蛋白，在質(zhì)量控制中一般需要控制具有18-22個(gè)唾液酸殘基的達(dá)依泊汀α達(dá)到總組分的 80%以上。
[0007] 等電聚焦法是分析達(dá)依泊汀α糖組成成份的一種常用分離分析方法，這也是中 國(guó)藥典規(guī)定的分析EPO的方法。但是用等電聚焦法只能做到定性分析，無(wú)法做到定量分析。
[0008] 清華大學(xué)周國(guó)華等利用毛細(xì)管電泳技術(shù)測(cè)定rHuEPO的唾液酸微多相性。毛細(xì)管 電泳分離是基于分子的體積/電荷比，其分離效率高于高效液相色譜。rHuEPO的糖基是唾 液酸化的，并且唾液酸化的程度差異較大，例如N-連接糖鏈可能帶四個(gè)唾液酸，也可能 帶三個(gè)、兩個(gè)或一個(gè)唾液酸。rHuEPO的等電點(diǎn)在4.0左右，當(dāng)介質(zhì)的p H值大于等電點(diǎn) 后，唾液酸帶負(fù)電，故可根據(jù)唾液酸的多少，通過(guò)電泳加以分離。毛細(xì)管電泳將rHuEPO 分離成7個(gè)峰，這是由糖蛋白的唾液酸微多相性引起的，而在體積排阻H P L C中僅有一 個(gè)rHuEPO峰，因唾液酸與rHuEPO的體內(nèi)活性有關(guān)，所以毛細(xì)管電泳比H P L C更能反映 rHuEPO的純度微多相性及生物學(xué)活性。
[0009]目前還沒(méi)有毛細(xì)管電泳技術(shù)測(cè)定達(dá)依泊汀α糖組成成份的報(bào)道。由于達(dá)依泊汀 α的等電點(diǎn)在3. 3左右，分離該酸性蛋白需要在較低的pH條件下進(jìn)行，而這種低pH環(huán)境對(duì) 于酸性蛋白的分離有較大負(fù)面影響，采用清華大學(xué)周國(guó)華等報(bào)道的毛細(xì)管電泳條件分離達(dá) 依泊汀α無(wú)法取得良好的分離效果。本申請(qǐng)發(fā)明人經(jīng)過(guò)多次摸索，建立了具有良好分離效 果的達(dá)依泊汀α毛細(xì)管電泳技術(shù)，實(shí)現(xiàn)完全的基線分離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種新的基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的達(dá)依泊汀α精細(xì)結(jié) 構(gòu)的分析方法，可用于達(dá)依泊汀α藥物生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制。
[0011] 本發(fā)明涉及的毛細(xì)管電泳方法包括以下步驟：
[0012] (1)、通過(guò)毛細(xì)管電泳對(duì)含有達(dá)依泊汀α的樣品進(jìn)行分離；
[0013] (2)、根據(jù)色譜峰面積對(duì)具有不同糖組分達(dá)依泊汀α進(jìn)行定量測(cè)定。
[0014] 本發(fā)明所使用石英毛細(xì)管總長(zhǎng)范圍在70~200cm之間（柱有效長(zhǎng)度為柱總長(zhǎng)減 去10cm),柱內(nèi)徑可以用25~75 μ m。優(yōu)選石英毛細(xì)管內(nèi)徑40~60 μ m，總長(zhǎng)90~140cm ;
[0015] 本發(fā)明所用的毛細(xì)管電泳緩沖液包括能維持在水溶液狀態(tài)下pH范圍為3. 3-5. 5 的任一種緩沖液、I-IOmM的腐胺和1-9M的尿素。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，在緩沖液中加入腐胺和 尿素能夠影響達(dá)依泊汀α在毛細(xì)管電泳過(guò)程中的遷移速度，從而可以提高不同糖組分的 達(dá)依泊汀α的分離度。
[0016] 優(yōu)選的，所使用的緩沖溶液可選自醋酸緩沖液或磷酸緩沖液，pH范圍為3. 6~ 4. 5,緩沖溶液中可加入I-IOmM腐胺和1-9M尿素。更優(yōu)選的，所述的緩沖溶液包含1~ IOOmM氯化鈉，1~IOOmM甘氨酸，1~IOOmM乙酸鈉，4~9M尿素，I-IOmM腐胺，pH范圍為 3. 6~4. 5。更優(yōu)選的，所述的緩沖溶液包括5~20mM氯化鈉，5~20mM甘氨酸，5-20mM乙 酸鈉，5~8M尿素，2-5mM腐胺，pH范圍為3. 6~4. 5。
[0017] 本發(fā)明毛細(xì)管電泳的電極電壓為10~50kv，優(yōu)選可為20~40KV。
[0018] 本發(fā)明所述方法的毛細(xì)管電泳采用壓力進(jìn)樣，壓力范圍為30~60mbar，時(shí)間范圍 為5~30s。優(yōu)選進(jìn)樣壓力范圍為40~50mbar，時(shí)間范圍為10~20s ;
[0019] 本發(fā)明所使用的柱溫范圍為10~40°C，優(yōu)選為25~35°C ;
[0020] 本發(fā)明所使用檢測(cè)波長(zhǎng)為紫外210-232nm，優(yōu)選為214nm。
[0021] 作為優(yōu)選，毛細(xì)管電泳分離的條件范圍為：
[0022] 本發(fā)明所使用石英毛細(xì)管總長(zhǎng)范圍在70~200cm之間，柱內(nèi)徑可以用25~ 75 μ m ;所用的毛細(xì)管電泳緩沖液包括能維持在水溶液狀態(tài)下pH范圍為3. 3-5. 5的任一種 緩沖液、I-IOmM的腐胺和1-9M的尿素；毛細(xì)管電泳的電極電壓為10~50kv ;電泳時(shí)采用壓 力進(jìn)樣，壓力范圍為30~60mbar，時(shí)間范圍為5~30s ;柱溫范圍為10~40°C，檢測(cè)波長(zhǎng) 為紫外 210-232nm ;
[0023] 更優(yōu)選的，本發(fā)明的毛細(xì)管電泳分離的條件范圍為：
[0024] 本發(fā)明所使用石英毛細(xì)管總長(zhǎng)范圍在90~140cm之間，柱內(nèi)徑可以用40~ 60 μ m ;毛細(xì)管電泳緩沖溶液可選自醋酸緩沖液或磷酸緩沖液，pH范圍為3. 6~4. 5,緩沖溶 液中可加入I-IOmM腐胺和1-9M尿素；毛細(xì)管電泳的電極電壓為10~50kv ;電泳時(shí)采用壓 力進(jìn)樣，壓力范圍為30~60mbar，時(shí)間范圍為5~30s ;柱溫范圍為10~40°C，檢測(cè)波長(zhǎng) 為紫外 210-232nm ;
[0025] 更優(yōu)選的，本發(fā)明的毛細(xì)管電泳分離的條件范圍為：
[0026] 本發(fā)明所使用石英毛細(xì)管總長(zhǎng)范圍在90~140cm之間，柱內(nèi)徑可以用40~ 60 μ m ;毛細(xì)管電泳緩沖溶液包含1~IOOmM氯化鈉，1~IOOmM甘氨酸，1~IOOmM乙酸鈉， 4~9M尿素，I-IOmM腐胺，pH范圍為3. 6~4. 5 ;毛細(xì)管電泳的電極電壓為20~40kv ;電泳 時(shí)采用壓力進(jìn)樣，壓力范圍為40~50mbar，時(shí)間范圍為10~20s ;柱溫范圍為25~35°C， 檢測(cè)波長(zhǎng)為紫外214nm。
[0027] 更優(yōu)選的，本發(fā)明的毛細(xì)管電泳分離的條件范圍為：
[0028] 本發(fā)明所使用石英毛細(xì)管總長(zhǎng)范圍在90~140cm之間，柱內(nèi)徑可以用40~ 60 μ m ;毛細(xì)管電泳緩沖溶液包括5~20mM氯化鈉，5~20mM甘氨酸，5-20mM乙酸鈉，5~ 8M尿素，2-5mM腐胺，pH范圍為3. 6~4. 5 ;毛細(xì)管電泳的電極電壓為20~40kv ;電泳時(shí)采 用壓力進(jìn)樣，壓力范