一種測(cè)定人血漿中丹參素,間位甲基丹參素,原兒茶醛及原兒茶酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物含量的測(cè)定方法，特別涉及一種測(cè)定人血漿中丹參素，間位 甲基丹參素，原兒茶醛及原兒茶酸的方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 復(fù)方丹參滴丸為天士力公司開發(fā)的活血化瘀、理氣止痛中藥，用于胸中憋悶、心絞 痛，其主要成分為丹參、三七、冰片，其藥理作用包括1增加冠脈血流量，2增加心肌耐缺氧 保護(hù)缺血心肌,3抗血小板聚集防止血栓形成，4改善微循環(huán)。
[0003] 復(fù)方丹參滴丸中丹參味苦，性微寒，具有活血化瘀，養(yǎng)血安神，涼血排癰和排毒生 肌的功效，是中藥活血化瘀的常用藥物。丹參藥材主含脂溶性的二萜類成分和水溶性的酚 酸類成分，尚含有黃酮類、三萜類、留醇等其他成分。二萜類成分中屬醌、酮型結(jié)構(gòu)的有丹參 酮I、IIA、IIK、V、VI，隱丹參酮，異丹參酮I、II、IIB，二氫丹參酮I等。水溶性的酚酸類成 分有丹參素，原兒茶醛，咖啡酸及丹參素與咖啡酸的衍生物或二聚物酯化而成的縮酚酸。
[0004] 丹參素、原兒茶醛是復(fù)方丹參滴丸的主要成分，近年來，有關(guān)生物樣品中丹參素、 原兒茶醛、原兒茶酸的含量測(cè)定方法（如HPLC、LC-MS/MS等）有較多報(bào)道，但大多為上述化 合物單獨(dú)測(cè)定的方法。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，丹參素、原兒茶醛在人體會(huì)分別代謝生成間位丹參素和 原兒茶酸。
[0005] 中藥藥物代謝動(dòng)力學(xué)是應(yīng)用動(dòng)力學(xué)原理，研究中藥活性成分、組分、單味藥和復(fù)方 體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄和毒性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及其體內(nèi)時(shí)-量、時(shí)-效關(guān)系，并用數(shù)學(xué) 函數(shù)加以定量描述的一門新興學(xué)科。開展中藥藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究對(duì)闡明和揭示中藥藥 效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，設(shè)計(jì)及優(yōu)選中藥給藥方案，促進(jìn)中藥新藥研發(fā)、劑型改進(jìn)及質(zhì)量控 制，均具有重要意義。目前中藥藥動(dòng)學(xué)研究方法歸納起來可分為兩大類，一類是針對(duì)成分明 確的中藥及復(fù)方，即血藥濃度法；另一類是化學(xué)基礎(chǔ)研究薄弱成分尚不明確的中藥及復(fù)方， 該類主要以生物效應(yīng)法為研究手段，包括藥理效應(yīng)法、藥物累積法、效量半衰期法、微生物 法等。液相色譜質(zhì)譜法是最近十幾年來發(fā)展起來的一種新的分離分析方法，由于其高選擇 性和高靈敏度已成為藥代動(dòng)力學(xué)研究的一種較理想的檢測(cè)方法。
[0006] 為深入研究復(fù)方丹參滴丸主要成分在人體內(nèi)的吸收及代謝過程，需要建立一種丹 參素、原兒茶醛及其代謝產(chǎn)物同時(shí)測(cè)定的方法。
[0007] 本發(fā)明經(jīng)過研究找到一種丹參素、原兒茶醛、間位丹參素和原兒茶酸人血漿中聯(lián) 測(cè)的LC-MS/MS方法，本方法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，滿足人體 藥代動(dòng)力學(xué)要求。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 人在服用含有丹參的藥物，如復(fù)方丹參滴丸后，經(jīng)過吸收和代謝，血漿中含有丹參 素，間位甲基丹參素，原兒茶醛及原兒茶酸。為檢測(cè)服用復(fù)方丹參滴丸后人體血漿中上述成 分的含量本發(fā)明提供了一種測(cè)定人血漿中丹參素，間位甲基丹參素，原兒茶醛及原兒茶酸 的方法，所述方法，包括以下步驟：
[0009] 1)對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備
[0010] 稱取丹參素、間位甲基丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸對(duì)照品，用甲醇溶解，即得丹 參素、間位甲基丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。
[0011] 2)內(nèi)標(biāo)溶液的制備
[0012] 取內(nèi)標(biāo)物香草酸用甲醇溶解即得內(nèi)標(biāo)溶液。
[0013] 3)血漿樣品處理方法
[0014] 取血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)溶液，甲醇，鹽酸，乙酸乙酯，混合均勻后，離心取上清乙酸 乙酯層，干燥，用甲醇復(fù)溶，離心，得血漿樣品上清液。
[0015] 4)含量測(cè)定
[0016] 采用LC-MS/MS色譜法，將上述對(duì)照品儲(chǔ)備液和血漿樣品上清液注入色譜儀，得到 色譜圖，根據(jù)色譜圖中色譜峰的面積計(jì)算丹參素、間位甲基丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸在 血漿中的濃度。
[0017] 優(yōu)選的，所述方法，包括以下步驟：
[0018] 1)對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備
[0019] 分別稱取丹參素、間位甲基丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸對(duì)照品，分別用甲醇配成 濃度為150-250i!g/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液I。
[0020] 分別取4種對(duì)照品儲(chǔ)備液I，分別用40-60% (V/V)甲醇水溶液配制濃度均為 2-6yg/ml的各自的對(duì)照品儲(chǔ)備液II。
[0021] 2)內(nèi)標(biāo)溶液的制備
[0022] 稱取內(nèi)標(biāo)物香草酸用甲醇配制成150-250yg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，進(jìn)一步用甲醇配 制成3-7iig/ml的香草酸內(nèi)標(biāo)溶液。
[0023] 3)血漿樣品處理方法
[0024] 取血漿樣品150-250iil，依次加入內(nèi)標(biāo)溶液30-70iil，40-60% (V/V)甲醇水溶液 30-70yl，0. 5-2mol/L的鹽酸溶液10-30yl，渦旋均勻，加入0. 5-2ml乙酸乙酯，渦旋振蕩 20-40s，離心，取上清乙酸乙酯層500-1200iil，用氮?dú)饬鞔蹈?，?00-150iil40-60% (V/V) 甲醇水溶液復(fù)溶，離心，得血漿樣品上清液。
[0025] 4)含量測(cè)定
[0026] 采用LC-MS/MS色譜法，將上述各自的對(duì)照品儲(chǔ)備液II和血漿樣品上清液注入色 譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖中色譜峰的面積計(jì)算丹參素、間位甲基丹參素、原兒茶醛和 原兒茶酸在血漿中的濃度。
[0027] 最優(yōu)選的，所述方法，包括以下步驟：
[0028] 1)對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備
[0029] 分別精密稱取丹參素對(duì)照品、間位甲基丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸對(duì)照品各 10.Omg分別置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得丹參素、間位甲基丹參 素、原兒茶醛和原兒茶酸濃度均為200g/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液I。
[0030]精密量取200ill各自對(duì)照品儲(chǔ)備液I，分別用50%甲醇水溶液定容至10ml，即得 丹參素、間位甲基丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸濃度均為4yg/ml的各自的對(duì)照品儲(chǔ)備液 II。
[0031] 2)內(nèi)標(biāo)溶液的制備
[0032] 精密量取內(nèi)標(biāo)物香草酸10.Omg置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖 勻，即得200yg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，精密量取此內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液125ill置于5ml容量瓶中，用甲 醇溶解并稀釋至刻度，即得5yg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。
[0033] 3)血漿樣品處理方法
[0034]取血漿樣品200ill，依次加入內(nèi)標(biāo)溶液50ill，50%甲醇水溶液50ill，lmol/L的鹽 酸溶液20iU，渦旋均勻，加入lml乙酸乙酯，渦旋振蕩30s，15000rpm離心lmin，取上清乙 酸乙酯層900iil，40°C下氮?dú)饬鞔蹈?，?20iU50%甲醇水溶液復(fù)溶，15000rpm離心3min， 得血漿樣品上清液。
[0035] 4)含量測(cè)定
[0036] 采用LC-MS/MS色譜法，將上述對(duì)照品儲(chǔ)備液II和血漿樣品上清液注入色譜儀，得 到色譜圖，根據(jù)色譜圖中色譜峰的面積計(jì)算丹參素、間位甲基丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸 在血漿中的濃度。
[0037] 其中所述LC-MS/MS色譜法，色譜條件如下：
[0038]色譜柱：C18 柱(優(yōu)選：DikmaDiamonsilC18 柱，50X2.lmm, 5ym);預(yù)柱：菲羅門公 司預(yù)柱（型號(hào)：KJ0_4282);流動(dòng)相：A相為0. 1%的甲酸水溶液和B相為含0. 1%甲酸的甲 醇，進(jìn)行梯度洗脫：〇_〇? 5minl% ~4%(優(yōu)選 2%) (B)，0? 5-4. 5minl% ~4% 至 75% ~95% (優(yōu) 選 2% 至 85%) (B)，4. 51-5min75% ~95% 至 95% (優(yōu)選 85% 至 95%) (B)，5. 01-6. 5min75% ~ 95% 至 1% ~4% (優(yōu)選 95% ~2%) (B);流速：0? 2 ~0? 5ml/min(優(yōu)選：0? 35ml/min);柱溫： 15~35°C(優(yōu)選：25°C);進(jìn)樣器溫度：2~10°C(優(yōu)選：4°C)。
[0039] 質(zhì)譜條件：采用ESI離子源，負(fù)離子模式。選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM)進(jìn)行二級(jí) 質(zhì)譜分析。相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)如下〖CollisionGas:Medium;IonSprayVoltage:-3000~-5500V(優(yōu)選：-4200V);Temperature:400~70(TC(優(yōu)選60(TC);CurtainGas:10. 0~ 40.0(優(yōu)選20.0;IonSourceGasl:40.0~80.0(優(yōu)選：60.0);IonSourcGas2:35.0~ 75. 0(優(yōu)選：55. 0)。
[0040] 在上述色譜條件下，丹參素、間位甲基丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸分別在 3. 15min、3. 92min、3. 63min和3. 25min左右出峰，內(nèi)標(biāo)（香草酸）在4. 13min左右出峰，峰 形良好，說明人血漿中無雜質(zhì)峰干擾上述化合物的測(cè)定，表明該方法具有較強(qiáng)的專屬性。色 譜圖詳見圖1。
[0041] 本發(fā)明研究了液相色譜質(zhì)譜法（LC-MS/MS法)同時(shí)測(cè)定人血漿中丹參素，間位甲基 丹參素，原兒茶醛及原兒茶酸的方法。在實(shí)驗(yàn)確定的樣品處理及一定色譜條件下，丹參素 (DSS)在 1. 38-1000ng/ml范圍內(nèi)的r為 0. 9978,間位甲基丹參素（m-DSS)在 0. 46-1000ng/ ml范圍內(nèi)的r為0. 9977,原兒茶醛（PCA)在0. 46-1000ng/ml范圍內(nèi)r為0. 9975,原兒茶 酸（PAA)在1. 38-1000ng/ml范圍內(nèi)r為0. 9948,4個(gè)化合物在各自濃度范圍內(nèi)具有良好 的線性關(guān)系（r>0. 994);測(cè)定丹參素、間位甲基丹參素、原兒茶醛及原兒茶酸分別在低濃度 4. 13ng/ml、中濃度37ng/ml和高濃度333. 3ng/ml時(shí)的提取回收率、日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn) 確度，表明本法采用血漿樣品處理方法對(duì)不同濃度的血漿樣品具有較為穩(wěn)定的提取效果， 日內(nèi)、日間精密度結(jié)果表明方法的重現(xiàn)性很好（RSD均小于13. 54%，指導(dǎo)原則規(guī)定RSD值應(yīng) 小于15%)，此外，實(shí)側(cè)濃度與理論濃度的相對(duì)誤差也小于15%，表明方法的準(zhǔn)確度很好；對(duì) 于丹參素、間位甲基丹參素、原兒茶醛及原兒茶酸的三個(gè)凍融周期穩(wěn)定性，對(duì)照品儲(chǔ)備液II 的穩(wěn)定性以及擬進(jìn)樣樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明丹參素、間位甲基丹參素、原兒茶 醛和原兒茶酸在上述存放或操作條件下具有良好的穩(wěn)定性（相對(duì)誤差均小于15%)，從而保 證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠。本實(shí)驗(yàn)所建立的同時(shí)測(cè)定人血漿中丹參素，間位甲基丹參素原兒茶 醛和原兒茶酸的LC-MS/MS分析方法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)， 滿足人體藥代動(dòng)力學(xué)要求，可應(yīng)用于臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。
[0042] 相關(guān)術(shù)語的解釋：
[0043] 丹參素：化學(xué)名為[D(+)-B_(3,4二羥基苯基）乳酸]，具有抵抗血小板粘附聚集， 清除氧自由基等作用，是中藥丹參（SalviamiltiorrhizaBunge)的有效成分之一。
[0044] 原兒茶醒：化學(xué)名為Benzaldehyde, 3, 4-dihydroxy-，3, 4-二羥基苯甲醒，存在于 丹參的根部，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈血流量作用，擴(kuò)張心腦血管，抑制血小板聚集等 作用。
[0045] 原兒茶酸：別名為3, 4-二羥基苯甲酸，存在于鱗始蕨科植物