一種基于金納米籠/氨基化石墨烯構(gòu)建禽類皰疹病毒抗原免疫傳感器的制備方法及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于金納米籠/氨基化石墨烯構(gòu)建禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器的制備方法及應用。具體是采用具有較大比表面積和較好催化效果的金納米籠/氨基化石墨烯復合材料，制備一種檢測禽類皰瘆病毒抗原的電化學免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前石墨烯由于其獨特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的電學、力學以及光學等性能，在物理、化學、材料乃至生物領(lǐng)域備受關(guān)注。石墨烯具有良好的生物相容性和較大的比表面積可用作生物傳感器、支架材料、藥物載體等，已成為納米生物學領(lǐng)域的研宄熱點；對其進行氨基功能化，不僅可以提高其水溶性，而且可以負載更多的貴金屬材料，用其作為金納米籠的載體。金納米籠具有較好的催化性能，將金納米籠和氨基功能化的石墨烯復合，來作為禽類皰瘆病毒抗原檢測抗體的標記物，達到檢測禽類皰瘆病毒抗原的目的，該方法具有成本低、操作簡單、特異性強、檢測快速等特點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的之一是基于金納米籠/氨基化石墨烯禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器的制備方法。
[0004]本發(fā)明的目的之二是將該電化學免疫傳感器應用于禽類皰瘆病毒抗原的檢測。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案
1.一種基于金納米籠/氨基化石墨烯構(gòu)建禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的三氧化二鋁拋光粉對玻碳電極拋光處理，用超純水清洗干凈，然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2-0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV ；
(2)以2mL質(zhì)量分數(shù)為1%的HAuCl4為底液，在電壓為-0.2V下掃描30s，得到電沉積金納米粒子的電極；
(3)滴加6μ?、5~10 Pg/mL的禽類皰瘆病毒抗原捕獲抗體Abi，4°C下晾干，超純水沖洗；
(4)繼續(xù)滴加3μ?、質(zhì)量分數(shù)為0.2-1%的牛血清白蛋白溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗；
(5)繼續(xù)滴加6μ?的一系列不同濃度的禽類皰瘆病毒抗原溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗；
(6)繼續(xù)滴加4~6μ?檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2S液至電極表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一種基于金納米籠/氨基化石墨烯構(gòu)建禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器。
[0006]2.檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯4132溶液的制備
(1)銀納米立方體的制備
將5 mL的無水乙二醇置于燒瓶中，160°C下加熱I h，在攪拌下，將1~5 mL、0.25 mol/LAgNOj^乙二醇溶液和3 mL、0.19 mol/L聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液同時加入到燒瓶中，繼續(xù)反應40 min，冷卻至室溫，用乙醇和超純水洗滌后重新分散到超純水中，得到銀納米立方體的溶液；
(2)金納米籠的制備
取50~200 μ L銀納米立方體溶液加入到5 mL的超純水中，100°C下回流10 min，攪拌下將0.05~2 mL、l m mol/L的HAuCljK溶液逐滴加入，繼續(xù)反應20 min，直到溶液的顏色穩(wěn)定，冷卻到室溫，加入飽和NaCl來除去AgCl固體，以10000 rpm轉(zhuǎn)速離心分離15 min，用水洗滌數(shù)次后，將其重新分散到超純水中，得到金納米籠的溶液；
(3)檢測抗體標記物一金納米籠/氨基化石墨烯的制備
分別將15~25 mg的氨基化石墨烯分散到10~40 mL的金納米籠的溶液中，室溫下震蕩12 h ;混合物經(jīng)洗滌、離心分離、35°C下真空干燥，制得金納米籠/氨基化石墨烯；
(4)檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制備
將1~3 mg的金納米籠/氨基化石墨稀分散于I mL超純水中，加入I mL、8~12 μ g/mL的檢測抗體溶液，在4°C下振蕩孵化12 h，離心分離，將下層沉淀加入至I mL、l/15 mol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中，制得檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2S液，4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0007]3.禽類皰瘆病毒抗原的檢測方法
(1)使用電化學工作站用三電極體系進行測定，將權(quán)利要求1所制備的免疫傳感器作為工作電極，飽和甘汞電極為對電極，鉑絲電極為輔助電極，在pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，采用時間-電流的方法進行掃描，輸入電壓為-0.4 V，運行時間400 S，記錄電流變化；
(2)在10mL, pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中對0.001-50 ng/mL的禽類皰瘆病毒抗原標準溶液進行測試記錄電流變化，根據(jù)所得電流差值與禽類皰瘆病毒抗原的濃度成線性關(guān)系，繪制工作曲線；
(3)將待測樣品溶液代替禽類皰瘆病毒抗原標準溶液進行檢測。
[0008]本發(fā)明的有益成果
(O電鍍的金納米粒子具有較好的導電性，以及良好的生物相容性和穩(wěn)定性，另外，其能夠結(jié)合大量的捕獲抗體，提高了捕獲抗體在其表面的負載量，增加了傳感器靈敏度和穩(wěn)定性。
[0009](2)金納米籠具有高的比表面積和良好的催化活性，將其和氨基化的石墨烯復合，能夠使得金納米籠均勻的分散在氨基化的石墨烯表面，氨基化的石墨烯較大的比表面積能夠提高了金納米籠在其表面的負載量，進而增加了和金納米籠結(jié)合檢測抗體的量。
[0010](3)本發(fā)明制備的電化學免疫傳感器用于禽類皰瘆病毒抗原的檢測，響應時間短，檢測限低，線性范圍寬，可以實現(xiàn)簡單、快速、高靈敏和特異性檢測。
【具體實施方式】
[0011]實施例1禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器的制備 (1)依次用1.0,0.3、0.05 Mm的三氧化二鋁拋光粉對玻碳電極拋光處理，用超純水清洗干凈，然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2-0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV ；
(2)以2mL質(zhì)量分數(shù)為1%的HAuCl4為底液，在電壓為-0.2V下掃描30s，得到電沉積金納米粒子的電極；
(3)滴加6μ?、5 Pg/mL的禽類皰瘆病毒抗原捕獲抗體Ab1,4°C下晾干，超純水沖洗；
(4)繼續(xù)滴加3PL、質(zhì)量分數(shù)為0.2%的牛血清白蛋白溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗；
(5)繼續(xù)滴加6μ?的一系列不同濃度的禽類皰瘆病毒抗原溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗；
(6)繼續(xù)滴加4μ?檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯4132溶液至電極表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一種基于金納米籠/氨基化石墨烯構(gòu)建禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器。
[0012]實施例2禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器的制備
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的三氧化二鋁拋光粉對玻碳電極拋光處理，用超純水清洗干凈，然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2-0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV ；
(2)以2mL質(zhì)量分數(shù)為1%的HAuCl4為底液，在電壓為-0.2V下掃描30s，得到電沉積金納米粒子的電極；
(3)滴加6μ?、7 Pg/mL的禽類皰瘆病毒抗原捕獲抗體Ab1,4°C下晾干，超純水沖洗；
(4)繼續(xù)滴加3PL、質(zhì)量分數(shù)為0.5%的牛血清白蛋白溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗；
(5)繼續(xù)滴加6μ?的一系列不同濃度的禽類皰瘆病毒抗原溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗；
(6)繼續(xù)滴加5μ?檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯4132溶液至電極表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一種基于金納米籠/氨基化石墨烯構(gòu)建禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器。
[0013]實施例3禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器的制備
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的三氧化二鋁拋光粉對玻碳電極拋光處理，用超純水清洗干凈，然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2-0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV ；
(2)以2mL質(zhì)量分數(shù)為1%的HAuCl4為底液，在電壓為-0.2V下掃描30s，得到電沉積金納米粒子的電極；
(3)滴加6μ?、10 Pg/mL的禽類皰瘆病毒抗原捕獲抗體Ab1,4°C下晾干，超純水沖洗；
(4)繼續(xù)滴加3PU質(zhì)量分數(shù)為1%的牛血清白蛋白溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗；
(5)繼續(xù)滴加6μ?的一系列不同濃度的禽類皰瘆病毒抗原溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗；
(6)繼續(xù)滴加6μ?檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯4132溶液至電極表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一種基于金納米籠/氨基化石墨烯構(gòu)建禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器。
[0014]實施例4檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制備
(1)銀納米立方體的制備
將5 mL的無水乙二醇置于燒瓶中，160°C下加熱I h，在攪拌下，將I mL、0.25 mol/LAgNOj^乙二醇溶液和3 mL、0.19 mol/L聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液同時加入到燒瓶中，繼續(xù)反應40 min,冷卻至室溫，用乙醇和超純水洗滌后重新分散到超純水中，得到銀納米立方體的溶液；
(2)金納米籠的制備
取50 μ L銀納米立方體溶液加入到5 mL的超純水中，100°C下回流10 min，攪拌下將0.05 mL、l mmol/L