一種生物樣品中醇類化合物的分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種醇類化合物的祀上衍生化-基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜-傅立葉變換 離子回旋共振質(zhì)譜（MALDI-FTICRM巧分析方法，其特征是W嗟咐駿酸為衍生化試劑和基 質(zhì)，在質(zhì)譜的祀板上與醇類化合物反應(yīng)，生成衍生化產(chǎn)物，同時過量嗟咐駿酸為基質(zhì)，從而 提高M(jìn)LDI離子化效率，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜分析醇類化 合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 醇類化合物如膽固醇、脂肪醇、維生素A、類固醇激素、麥角醬醇等是人體內(nèi)重要的 代謝物和抗真菌藥物作用祀點(diǎn)，與多種代謝酶的功能相關(guān)。該些化合物的含量變化可W反 應(yīng)疾病和人體內(nèi)代謝酶的異常，例如，人體內(nèi)膽固醇含量變化與阿爾茨海默病，冠屯、病等多 種疾病相關(guān)；人體中脂肪醇含量與Sjogren-Larsson綜合癥，DHAP合酶缺乏等疾病相關(guān)；真 菌細(xì)胞的醬醇代謝是抗真菌藥物作用祀點(diǎn)和真菌耐藥機(jī)制之一。因此，對生物樣本（如血 漿，尿液、毛發(fā)、細(xì)胞）中醇類化合物進(jìn)行定性和定量分析對研究許多生理變化、疾病診斷 和藥物篩選有非常重要的作用。
[0003] 生物樣本（如尿液、毛發(fā)、細(xì)胞）中醇類化合物的分析方法主要是高效液相色 譜-質(zhì)譜（LC-M巧和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-M巧，但前處理較復(fù)雜，需要分離純化，不能滿足 高通量篩選的需要，基質(zhì)輔助激光解吸離子化一傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（MALDI-FT ICRM巧由于其高分辨率，高通量和高靈敏度而具有極大的優(yōu)勢，簡化繁瑣的樣品處理步 驟，F(xiàn)TMS的高分辨率使我們能夠檢測復(fù)雜樣本中質(zhì)荷比十分接近的化合物。MLDI-FTICR MS已被廣泛應(yīng)用于各種生物樣本中內(nèi)源性物質(zhì)的定性和定量分析。
[0004] 在已有報道的的生物樣本中醇類化合物的分析方法中，醇類化合物由于其較弱 的質(zhì)子親和力和較弱的酸性，不易電離，在MLDI和ESI中信號較弱，靈敏度較低，且易被 其他易電離的物質(zhì)抑制。為了提高其質(zhì)譜響應(yīng)，已有各種不同的衍生化試劑被開發(fā)出，甜 菜醒（參見胖11，(：.口.；^3,0.尺.；]\&111^1?5，仇6.;(：〇〇1^3，尺.6.八1131.〇16111.2009,81，7618-7624.) ,2- [I比晚甲酸（參見Higashi,T.;化ibayama,Y.J. ;Shimada,K.J.Qiromatogr. B2007, 846, 195-201.)，2-氨基化嗦（Analyst, 2013, 138, 6270-6276)和丹橫酷氯（參見 Tang,Z.M.;PeterGuengerich,F.Anal.Qiem. 2010,82, 7706 - 7712.)被用于衍生化醇類化 合物。但該些方法都存在缺點(diǎn)，包括前處理較復(fù)雜，過量的衍生化試劑需要除去，衍生化試 劑本身有較強(qiáng)的離子化效率，會抑制待測物的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的問題是；提供一種基于嗟咐駿酸的基質(zhì)衍生化方法結(jié)合MLDI-FT ICRMS用于定性分析生物樣本中醇類化合物的方法，進(jìn)一步說是一種通過祀上醋化反應(yīng)， 將該些醇類化合物轉(zhuǎn)化為嗟咐醋，過量的試劑發(fā)揮基質(zhì)的作用，該樣可W極大地提高目標(biāo) 化合物在隨后基質(zhì)輔助激光解吸離子化一傅立葉變換質(zhì)譜分析中的分析靈敏度和特異性， 無須復(fù)雜的樣品前處理過程，用于高通量定性分析生物體樣本中的醇類化合物，為一種快 速、高效、靈敏的分析方法，為進(jìn)一步研究該類化合物在體內(nèi)含量變化與生理功能、疾病的 關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種生物樣品中醇類化合物的分析方法，其包括 如下步驟：
[0007] 將經(jīng)過前處理的樣品用有機(jī)溶劑萃取后，取有機(jī)層進(jìn)行干燥后加入嗟咐駿酸的己 膳溶液W及碳酷氯的二氯甲燒溶液，得到反應(yīng)液；
[0008] 將所述反應(yīng)液點(diǎn)樣0. 5~1yL于激光解析-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜分析 儀的祀上，在15~40°C下反應(yīng)30~60分鐘，W過量的嗟咐駿酸作為基質(zhì)進(jìn)行基質(zhì)輔助激 光解析-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜分析，所述嗟咐駿酸與待測的醇類化合物的摩爾比 為 20:1-50:1;
[0009] 通過對比高分辨數(shù)據(jù)分析圖譜，獲得醇類化合物的定性結(jié)果；
[0010] 其中，所述樣品為含醇類化合物的生物體物質(zhì)，所述醇類化合物為膽固醇、真菌麥 角醬醇、雄酬、維生素D3、膽醬燒醇、脫氨膽固醇、豆醬醇、脫氨采油醬醇、羊毛醬醇中的一 種。
[0011] 本發(fā)明的原理是；使嗟咐駿酸與醇類化合物的發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，利用反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行 經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜分析醇類化合物的嗟咐駿酸衍生產(chǎn) 物。反應(yīng)式如圖1所示。
[0012] 作為優(yōu)選方案，所述嗟咐駿酸的己膳溶液中，嗟咐駿酸的濃度為2~5mg/mU體積 50-100ULo
[0013] 作為優(yōu)選方案，所述嗟咐駿酸為嗟咐-3-駿酸、嗟咐-4-駿酸、嗟咐-5-駿酸、嗟 咐-6-駿酸、嗟咐-7-駿酸或嗟咐-8-駿酸。
[0014] 作為優(yōu)選方案，所述碳酷氯的二氯甲燒溶液中，碳酷氯的體積分?jǐn)?shù)為10~40%， 體積 50-100uL。
[0015] 作為優(yōu)選方案，所述樣品的前處理過程為：將樣品加入1~2mL體積比1:1的氨氧 化鐘/己醇溶液，在60~70°C下皂化水解1~化。
[0016]作為優(yōu)選方案，所述基質(zhì)輔助激光解析-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜分析的 條件是：激光能量20~30 %，掃描范圍；m/z100~1500,頻率：1000Hz，斑點(diǎn)直徑500~ 1000ym，數(shù)據(jù)采集均在正離子模式下進(jìn)行；子離子掃描條件；碰撞能10-30eV。
[0017] 作為優(yōu)選方案，所述樣品為毛發(fā)或酵母細(xì)胞。
[001引與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0019] 1、用于在MLDI祀上特異性衍生化醇哲基，在質(zhì)譜分析的過程中更有針對性，提 高待測物的離子化效率，增強(qiáng)了分析靈敏度（檢測限0.2-0. 5ng/mL);
[0020] 2、祀上反應(yīng)后無需復(fù)雜的樣品前處理過程，反應(yīng)后直接分析，實(shí)現(xiàn)高通量分析，操 作簡便，高分辨率使我們能夠檢測復(fù)雜樣本中質(zhì)荷比十分接近的化合物；
[0021] 3、此發(fā)明所用的衍生化試劑簡單，易得，標(biāo)記部分相對較?。?73化），結(jié)構(gòu)也相對 簡單，性質(zhì)比較穩(wěn)定，在質(zhì)譜子離子掃描分析中碰撞能作用下可產(chǎn)生脫去一分子嗟咐駿酸 醋碎片離子[M-172]+，提高選擇性，有利于增強(qiáng)定性分析的準(zhǔn)確性。
[0022] 本發(fā)明被應(yīng)用于定性分析各類生物樣品中的醇類化合物，膽固醇、膽醬燒醇、真菌 麥角醬醇，雄酬，維生素D3,脫氨膽固醇、豆醬醇、谷醬醇、菜油醬醇，脫氨菜油醬醇、羊毛醬 醇等。通過此方法可W實(shí)現(xiàn)快速、高效、靈敏的檢測醇類化合物。
【附圖說明】
[0023] 通過閱讀參照W下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得