電化學(xué)發(fā)光電極陣列的制備和修飾方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及在生物檢測技術(shù)領(lǐng)域中使用的一種電化學(xué)發(fā)光微陣列芯片的電極制 備以及表面修飾方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence)是在電化學(xué)反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象的結(jié) 合產(chǎn)物。在化學(xué)反應(yīng)過程中，分子由于吸收了化學(xué)反應(yīng)所釋放的能量而產(chǎn)生所謂"能量躍 迀"，由基態(tài)轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)。當(dāng)分子從激發(fā)態(tài)重新衰變成基態(tài)時(shí)釋放出光子即產(chǎn)生 化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。電化學(xué)發(fā)光又被稱為電至化學(xué)發(fā)光，與普通化學(xué)發(fā)光不同的是，電化學(xué)發(fā)光 依賴在激發(fā)電極表面產(chǎn)生的氧化還原反應(yīng)。在目前最常用的三丙胺-吡啶釕電化學(xué)發(fā)光體 系中，化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2 +和電子供體三丙胺（TPA)在陽極表面分別被氧 化成[Ru(bpy)3]3+和TPA+'TPA+?很不穩(wěn)定，很容易失去一個(gè)質(zhì)子（H+)而形成強(qiáng)還原劑 TPA?。當(dāng)[Ru(bpy)3]3+和TPA?發(fā)生氧化還原反應(yīng)時(shí)，[Ru(bpy) 3]3+被TPA?還原形成激 發(fā)態(tài)的二價(jià)[Ru(bpy)3]2+-，TPA?被氧化成二丙胺和丙醛。接著激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+?衰 減成基態(tài)的[Ru(bpy)3]2+，同時(shí)發(fā)射一個(gè)波長為614nm的光子。在三丙胺-吡啶釕電化學(xué) 發(fā)光體系中，發(fā)光分子三聯(lián)吡啶釕在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行基態(tài)_激發(fā)態(tài)-基態(tài)的能量 轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生大量光子。
[0003] 反應(yīng)電極是參與電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的主要控制因素之一。目前最常用的電化學(xué)發(fā)光 檢測電極主要采用金、銀、碳、導(dǎo)電玻璃等導(dǎo)電材質(zhì)，通過對電極進(jìn)行復(fù)雜的表面修飾來增 強(qiáng)電極對發(fā)生在其表面附近的化學(xué)反應(yīng)的催化能力，從而提高光信號強(qiáng)度。
[0004] 與普通化學(xué)發(fā)光相比，電化學(xué)發(fā)光具有試劑穩(wěn)定性好、反應(yīng)容易控制、試驗(yàn)結(jié)果重 復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但是電化學(xué)發(fā)光相對而言反應(yīng)更加復(fù)雜，尤其是對于激發(fā)電極的制作和修 飾對于檢測數(shù)值的穩(wěn)定性異常重要。為提高檢測靈敏度和降低變異系數(shù)（Coefficientof Variation)，通常需要對電極表面做許多修飾以改善捕獲探針裝載密度、均勻度、以及自由 度等參數(shù)。
[0005] 在微陣列芯片領(lǐng)域針式點(diǎn)樣法和液珠噴點(diǎn)法是目前最常用的捕獲探針加載方法， 然而，對于電化學(xué)發(fā)光微陣列而言，上述方法常常導(dǎo)致所加載的試劑在電極表面分布不均 勻，并且這些方法均需要采購昂貴的專用微陣列點(diǎn)樣設(shè)備。這導(dǎo)致目前電化學(xué)發(fā)光微陣列 檢測方法無法向普通化學(xué)發(fā)光微陣列檢測方法那樣被廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在電化學(xué)發(fā)光微陣列電極制備和修飾領(lǐng)域提供一 種簡易高效的電極陣列制備和修飾方法。其具有設(shè)備制作使用簡單、耗材成本低、操作方 便、檢測結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：（1)在電極陣列中，采用帶圓弧頂角的方形電極結(jié)構(gòu) 使電極表面積最大化并減少尖角效應(yīng)；（2 )采用同步法用配體或接枝分子修飾電極陣列中 的每一個(gè)電極表面以獲得均一的電極表面；（3)使用印痕法在電極表面加載捕獲探針分 子，加載捕獲探針印痕時(shí)，可采用逐次加載法或并行加載法；（4)采用較大的電極表面和相 對較小的相似形印模，使每個(gè)電極表面均可獲得一個(gè)完整的捕獲探針印痕，以提高反應(yīng)的 均一性。（5)對電極進(jìn)行充分的封閉處理以降低非特異性吸附。（電極陣列及捕獲探針印痕 樣式參見圖1、圖2)。
[0008] 當(dāng)固定在電極表面的探針捕捉住待檢目標(biāo)分子-電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物復(fù)合物時(shí)，電 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系在反應(yīng)電極表面進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生光信號，用光電倍增管（PMT) 檢測所產(chǎn)生的光信號。
[0009] 所述的電極陣列是指：由多個(gè)帶圓弧頂角的方形電極縱橫整齊排列形成的電極組 陣列，其中每個(gè)電極的表面積為〇. 25~25mm2,各電極之間的間距為0. 2~2mm。
[0010] 所述的同步法電極表面修飾是指：將電極陣列用同一批次試劑同時(shí)進(jìn)行修飾處 理。
[0011] 所述的配體包括：生物素、親和素、鏈霉親和素、抗抗體、以及分子印跡聚合物 (MolecularImprintedPolymer，MIP)〇
[0012] 所述的接枝分子組分包括：馬來酸酐（Maleicanhydride)，2-丙稀酰胺基-2-甲 基丙橫酸（2Acrylamido-2-MethylPropaneSulfonicAcid)，纖維素，聚乙稀醇 (Polyvinylalcohol)，聚乙二醇二稀丙基釀（PolyethyleneGlycolDiallylEther)，聚乙 稀P比略燒酮-醋酸乙稀醋共聚物（Polyvinylpyrrolidone-vinylacetatecopolymer)，聚 丙稀酸（Polyacrylicacid)、聚甲基丙稀酸縮水甘油醋（Glycidylmethacrylate)。
[0013] 所述的捕獲探針分子包括：生物素、親和素、捕獲抗體、肽核酸（P印tideNucleic Acid)探針或核酸探針。其中核酸探針包括基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、cRNA探 針以及寡核苷酸探針。
[0014] 所述的逐次加載法或并行加載法為：在電極陣列的每個(gè)電極表面依次逐個(gè)加載捕 獲探針印痕或采用與整個(gè)電極陣列對應(yīng)的印模一次性在每個(gè)電極上同時(shí)加載捕獲探針印 痕。
[0015] 所述的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為魯米諾及其衍生物或三聯(lián)吡啶釕衍生物。
[0016] 所述的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系包括：魯米諾體系、吡啶釕體系。魯米諾體系中電化學(xué) 發(fā)光標(biāo)記物為魯米諾及其衍生物，緩沖溶液含：1.〇mM3. 0mMH202,0. 05MNa2C03-NaHC03， pH811。吡啶釕體系中電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為三聯(lián)吡啶釕衍生物，緩沖溶液含：0. 03mM2.0 mM二丁基乙醇胺（DBAE)，0. 05M磷酸緩沖液，pH69。
[0017] 本發(fā)明的原理如下： 在電化學(xué)發(fā)光檢測過程中，電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系在電極表面產(chǎn)生電至氧化_還原反 應(yīng)，進(jìn)而通過"躍迀-衰變"過程產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光。在其它條件相同的情況下，發(fā)光強(qiáng)度與 電極表面有效面積和所加載的捕獲探針分子密度呈正相關(guān)性。所以電極表面有效面積大小 和捕獲探針分子密度的變化將導(dǎo)致發(fā)光值的變化，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定。
[0018] 現(xiàn)在常用的微陣列點(diǎn)陣方法，無論是針式點(diǎn)樣法還是噴液式點(diǎn)樣法，均無法保證 電極表面有效面積的均一性。針式點(diǎn)樣法由于點(diǎn)樣面與電極表面產(chǎn)生剛性接觸，比較容易 受到電極表面平整度和表面糙度的影響，同時(shí)針式點(diǎn)樣法不適合面積較大的電極。噴液式 點(diǎn)樣法易受溫、濕度的影響，同時(shí)，由于在電極表面的流動性較大，容易受電極表面浸潤性 的影響，從而導(dǎo)致試劑在電極表面分布不均勻。
[0019] 相對而言，本發(fā)明由于采用與電極表面形狀相似且小于電極表面的柔性點(diǎn)樣面， 所以具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1)點(diǎn)樣面與電極表面接觸緊密，受電極表面形狀影響小；（2)點(diǎn)樣 面的大小確定電極有效面積的大小，從而確保電極有效面積的一致性；（3 )由于點(diǎn)樣面與 電極表面形狀相似且小于電極表面，因此對于點(diǎn)樣過程中的印痕位置具有較好的容錯(cuò)度； (4)點(diǎn)樣面與電極表面可以有較長的接觸時(shí)間，可有效降低試液在電極表面的流動性，提 高試劑在電極表面分布的均勻度。此外，采用同步法用配體或接枝分子修飾微陣列中的每 一個(gè)電極表面不僅可以獲得均一的電極表面性狀，還可提高捕獲探針在電極表面的加載密 度，從而提高檢測靈敏度。
[0020] 本發(fā)明所采用的方法不僅可以提高電化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和靈敏度，而且 不需要購買昂貴的設(shè)備，操作簡單易行，使用成本大大降低。
【附圖說明】
[0021] 圖1是加載捕獲探針印痕前的電極陣列樣式示意圖。
[0022] 圖2是加載捕獲探針印痕后的電極陣列樣式示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 具體實(shí)施例一 電極陣列的制備：電極電路采用單層或多層印刷電路板制備，電極可以用金漿、銀漿、 或碳漿材料，采用低溫絲網(wǎng)印刷方法制備電極陣列。以下用超細(xì)銀漿低溫銀漿低溫絲網(wǎng)印 刷法為例，陳述電極陣列的制備方法： (1) 基板的制備：按照設(shè)計(jì)的電路布線采用單層或多層印刷電路板工藝制備； (2) 超細(xì)銀粉的制備：用離子水溶解硝酸銀，使硝酸銀濃度為100g/L;加入碳酸鈉溶 液沉淀出Ag2C03;室溫下調(diào)節(jié)pH值至8. 5左右、在攪拌下加入甲醛還原，得超細(xì)銀粉；將銀 粉用去離子水清洗干凈，添加分散劑，在低溫下烘干、篩濾備用； (3)銀粉的表面處理：以多元醇為分散劑，按質(zhì)量比配備相應(yīng)數(shù)量的鋼球，用臥式球磨 機(jī)球磨72~96小時(shí)，得到片狀銀粉，將片狀銀粉用去離子水清洗干凈，添加分散劑，在低溫 下烘干、篩濾備用； (4) 低溫銀漿制備：以聚氨酯為固化樹脂，將聚氨酯溶解于適量溶劑中，配制成濃度為 25%的樹脂溶液；將銀粉與樹脂溶液按照6: