一種c反應(yīng)蛋白膠體金檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種C反應(yīng)蛋白膠體金檢測(cè)試劑盒及其制 備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP)是由肝臟合成的一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為 1.15X103的五環(huán)結(jié)構(gòu)，在它的每一邊都有親鈣性結(jié)合位點(diǎn)，且其分子代謝周期的半衰期僅 為5-7小時(shí)，因此在補(bǔ)體系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)中扮演了一個(gè)重要的生物學(xué)角色。CRP是公認(rèn)的最 有價(jià)值的典型急性時(shí)相蛋白，正常血漿水平小于5mg/L，機(jī)體受到感染、外傷、腫瘤及理化因 素刺激后5-8小時(shí)迅速升高，24小時(shí)內(nèi)峰值可為正常值的數(shù)百倍。若感染得到控制CRP可 在24-48小時(shí)內(nèi)迅速下降，1周內(nèi)恢復(fù)正常。CRP可與凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞膜磷脂或細(xì)菌、真 菌、寄生蟲的細(xì)胞壁磷酸膽堿結(jié)合，激活補(bǔ)體，調(diào)理吞噬功能，促使內(nèi)源性或外源性配體物 質(zhì)的清除。
[0003] 目前，CRP的測(cè)定廣泛地應(yīng)用于臨床疾病的早期診斷及鑒別診斷，特別是快速定量 CRP檢測(cè)在兒科疾病的診斷中得到較好的應(yīng)用。在細(xì)菌感染急性期CRP水平顯著升高，而在 病毒感染時(shí)CRP水平正常或輕微升高，因此CRP水平可作為細(xì)菌感染或病毒感染首選鑒別 診斷指標(biāo)；在鑒別呼吸道感染時(shí)，細(xì)菌性肺炎常導(dǎo)致CRP水平升高到60mg/L以上，而急性支 氣管炎很少導(dǎo)致CRP水平的顯著升高，所以測(cè)定CRP水平有助于鑒別肺炎和支氣管炎，減少 對(duì)非細(xì)菌性急性支氣管炎患者予抗生素治療；外科手術(shù)后若病人繼發(fā)細(xì)菌感染特別是化膿 性感染時(shí)，CRP明顯升高（大于50mg/L)，手術(shù)第2天達(dá)到高峰，72小時(shí)后開始逐步下降，恢 復(fù)時(shí)間因手術(shù)部位和組織損傷程度而異，故CRP還可以作為診斷感染和手術(shù)后并發(fā)癥的一 項(xiàng)指標(biāo)；此外，研宄還表明CRP還可能與風(fēng)濕性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、外科學(xué)、婦產(chǎn)科學(xué)、 胃腸病學(xué)、血液學(xué)和腫瘤學(xué)等密切相關(guān)，應(yīng)用范圍還將不斷擴(kuò)大。
[0004] 超敏C反應(yīng)蛋白（hypersensitive-CRP，hs-CRP)與普通CRP就是同一種蛋白，只 是由于其測(cè)定方法更敏感而得名。采用臨床常規(guī)方法測(cè)定CRP時(shí)，檢測(cè)的線性范圍一般為 3-200mg/L，因檢測(cè)方法缺乏足夠的敏感性，無法測(cè)出血液中含量更低的CRP。近年來相繼采 用膠乳增強(qiáng)的免疫散射比濁法、免疫投射比濁法、免疫發(fā)光法等技術(shù)使檢測(cè)的靈敏度得到 了很大提高，檢測(cè)低限延伸為〇. 005~0. 10mg/L，使得低濃度CRP (如0. 15~10mg/L)的測(cè) 定更加準(zhǔn)確。
[0005] 近年來關(guān)于CRP、hs-CRP的研宄越來越多，應(yīng)用越來越廣泛。在感染、心腦血管性 疾病、糖尿病、代謝綜合征、外周血管病、慢性阻塞性肺病、哮喘、腫瘤等多種疾病中用于指 導(dǎo)臨床診療。目前已經(jīng)知道，CRP和hs-CRP的臨床意義并不完全相同。CRP在感染性疾病 和結(jié)締組織病中有較高的應(yīng)用價(jià)值，而hs-CRP近年來在心腦血管疾病、糖尿病中越來越受 到關(guān)注。
[0006] 人類C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP)是指在機(jī)體受到感染或組織損傷時(shí) 血漿中一些急劇上升的蛋白質(zhì)（急性蛋白）。CRP可以激活補(bǔ)體和加強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬而 起調(diào)理作用，從而清除入侵機(jī)體的病原微生物和損傷，壞死，凋亡的組織細(xì)胞，在機(jī)體的天 然免疫過程中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。關(guān)于CRP的研宄已經(jīng)有70多年的歷史，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為 CRP是一種非特異的炎癥標(biāo)志物，但近十年的研宄揭示了 CRP直接參與了炎癥與動(dòng)脈粥樣 硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最強(qiáng)有力的預(yù)示因子與危險(xiǎn)因子。
[0007] 作為急性時(shí)相反應(yīng)的一個(gè)極靈敏的指標(biāo)，血漿中CRP濃度在急性心肌梗死、創(chuàng)傷、 感染、炎癥、外科手術(shù)、腫癌浸潤(rùn)時(shí)迅速顯著地增高，可達(dá)正常水平的2000倍。結(jié)合臨床病 史，有助于隨訪病程。特別在炎癥過程中，隨訪風(fēng)濕病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病等。
[0008] C反應(yīng)蛋白測(cè)試可以鑒別細(xì)菌或病毒感染，監(jiān)測(cè)病情，監(jiān)控術(shù)后感染，抗生素療效 觀察，預(yù)測(cè)心血管病危險(xiǎn)等，C反應(yīng)蛋白對(duì)診斷和治療都很有價(jià)值，因此其測(cè)定速度就有重 要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種C反應(yīng)蛋白膠體金檢 測(cè)試劑盒及其制備方法和用途，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明的第一方面，提供一種C反應(yīng)蛋白膠體金檢測(cè)試劑盒，包括試紙卡，所述試 紙卡包括底板、及位于底板表面的從加樣端開始依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜 和吸水墊，所述金標(biāo)墊上包含膠體金標(biāo)記的抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體-1，所述硝酸纖維素 膜上包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線。
[0012] 優(yōu)選的，所述底板為PVC底板。
[0013] 優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜上，檢測(cè)線位于離加樣端較近一側(cè)，質(zhì)控線位于離加樣 端較遠(yuǎn)一側(cè)。
[0014] 優(yōu)選的，所述檢測(cè)線包括檢測(cè)線T1和檢測(cè)線T2,所述檢測(cè)線上包被有抗C反應(yīng)蛋 白單克隆抗體-2。
[0015] 優(yōu)選的，所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgG。
[0016] 所述抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體-1和抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體-2可以是相同的單 克隆抗體，也可以是不同的單克隆抗體。
[0017] 優(yōu)選的，所述抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體-1為Abeam?Anti-C Reactive Protein antibody [CRP135]，所述抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體-2 為Abeam?Anti-C Reactive Protein antibody [CRP-8] (abl3426)，或所述抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體-1為Abeam?.Anti-C Reactive Protein antibody[CRP_8](abl3426)，所述抗 C 反應(yīng)蛋白單克隆抗體 _2 為 Abeam?.Anti-C Reactive Protein antibody [CRP135]。
[0018] 優(yōu)選的，所述樣品墊采用緩沖液處理，所述緩沖液選自PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖 液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液和檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合，緩沖液 的濃度為50-100mM。
[0019] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述的金標(biāo)墊還經(jīng)過預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液選 自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為 10_40mM 〇
[0020] 更優(yōu)選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果，所述緩沖液還包括 NaCl和冠醚，所述冠醚選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一種或多種 的組合，NaCl在緩沖液中的濃度為0. l-20mg/ml，冠醚在緩沖液中的濃度為0. l-20mg/ml。
[0021] 更優(yōu)選的，NaCl在緩沖液中的濃度為0. 25-0. 5mg/ml，冠醚在緩沖液中的濃度為 4_8mg/ml〇
[0022] 所述預(yù)處理緩沖液的溶劑為水。
[0023] 所述預(yù)處理的具體步驟為：將金標(biāo)墊在預(yù)處理液中浸泡1. 5~2h，取出放于36~ 38°C烘干。
[0024] 所述預(yù)處理緩沖液可使用本領(lǐng)域各種常用的pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)。
[0025] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括卡殼，所述卡殼包括背卡和上蓋，所述背卡設(shè)有試紙卡 卡槽，所述試紙卡嵌于所述試紙卡卡槽內(nèi)，所述上蓋設(shè)有測(cè)試窗和加樣孔，所述測(cè)試窗的位 置與所述檢測(cè)線和質(zhì)控線的位置相配合，所述加樣孔的位置與所述樣品墊的位置相配合。
[0026] 更優(yōu)選的，所述卡殼為塑料卡殼。
[0027] 優(yōu)選的，所述檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)樣品中的C反應(yīng)蛋白，所述樣品選自人全血、血 清或血漿中的一種或多種的組合。
[0028] 本發(fā)明第二方面提供所述C反應(yīng)蛋白膠體金檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步 驟：
[0029] 1)用膠體金標(biāo)記的抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體-1溶液噴涂金標(biāo)墊，制得包含抗C反 應(yīng)蛋白單克隆抗體-1的金標(biāo)墊；
[0030] 2)在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線和質(zhì)控線上分別噴涂抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體-2及 羊抗鼠IgG，制得包被后的硝酸纖維素膜；
[0031] 3)將樣品墊、步驟1)制備金標(biāo)墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼 在底板上，切裁制得檢測(cè)試紙卡；最后將檢測(cè)試紙卡裝入卡殼制得檢測(cè)試劑盒。
[0032] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述的金標(biāo)墊還經(jīng)過預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液選 自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為 10_40mM 〇
[0033] 更優(yōu)選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果，所述緩沖液還包括 NaCl和冠醚，所述冠醚選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一種或多種 的組合，NaCl在緩沖液中的濃度為0. l-20mg/ml，冠醚在緩沖液中的濃度為0. l-20mg/ml。
[0034] 更優(yōu)選的，NaCl在緩沖液中的濃度為0.25-0. 5mg/ml，冠醚在緩沖液中的濃度為 4_8mg/ml〇
[0035] 所述預(yù)處理緩沖液的溶劑為水。
[0036] 所述預(yù)處理的具體步驟為：將金標(biāo)墊在預(yù)處理液中浸泡1. 5~2h，取出放于36~ 38°C烘干。
[0037] 所述預(yù)處理緩沖液可使用本領(lǐng)域各種常用的pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)。
[0038] 本發(fā)明第三方面提供所述C反應(yīng)蛋白膠體金檢測(cè)試劑盒在C反應(yīng)蛋白檢測(cè)領(lǐng)域的 用途。
[0039]本發(fā)明的有益效果為：
[0040] 本發(fā)明所提供的C反應(yīng)蛋白膠體金檢測(cè)試劑盒兼具高靈敏性和高特異性，能夠快 速檢測(cè)C反應(yīng)蛋白。此外，所述檢測(cè)試劑盒具有操作快速簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)適用等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0042] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一"和"這個(gè)"包括復(fù)數(shù)形式。
[0043] 當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0044] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技