用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率成像的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率成像的方法，其中，所述試樣在測量區(qū)域中被加載以熒光激發(fā)光，所述熒光激發(fā)光將發(fā)光體從可激發(fā)的電子基態(tài)激發(fā)到被激發(fā)的發(fā)光態(tài)，其中，試樣在測量區(qū)域中被加載以熒光退激發(fā)光的具有局部最小處的強(qiáng)度分布，所述熒光退激發(fā)光將發(fā)光體從被激發(fā)的發(fā)光態(tài)帶回到所述可激發(fā)的電子基態(tài)，其中，記錄從測量區(qū)域所發(fā)射的熒光，并且，所記錄的熒光配屬于局部最小處在試樣中的位置。
[0002]在這樣的方法中，由測量區(qū)域所發(fā)射的熒光的強(qiáng)度為局部最小處在試樣中的位置上的發(fā)光體濃度的量度。通過對局部最小處的每個位置重復(fù)以上所提到的步驟地掃描具有局部最小處的試樣來檢測發(fā)光體在試樣中的分布，并且因此描繪以發(fā)光體標(biāo)記的結(jié)構(gòu)。
[0003]在這里，用術(shù)語“發(fā)光體”是指這樣的任意物質(zhì):當(dāng)其處于被激發(fā)的發(fā)光態(tài)時，從該物質(zhì)可獲得作為測量信號的熒光。熒光染料尤其屬于這樣的物質(zhì)。但是，以熒光的發(fā)射為基礎(chǔ)的過程不必是熒光。也可以涉及散射、例如Raman散射，在所述散射中，從被激發(fā)的過渡狀態(tài)發(fā)射散射光，所述被激發(fā)的過渡狀態(tài)被看作被激發(fā)的發(fā)光態(tài)。
[0004]試樣的讓人感興趣的結(jié)構(gòu)可以本身具有發(fā)光體，即為自動發(fā)光的。然而，試樣的讓人感興趣的結(jié)構(gòu)也可以以發(fā)光體人工標(biāo)記。以發(fā)光體對結(jié)構(gòu)的人工標(biāo)記例如可以通過所謂的抗體染色、即通過發(fā)光體通過免疫反應(yīng)連接，或者通過基因技術(shù)的改變來進(jìn)行，所述基因技術(shù)的改變導(dǎo)致發(fā)光體與讓人感興趣的結(jié)構(gòu)的共同表達(dá)。
[0005]如果在這里談到一種狀態(tài)、例如發(fā)光體的可激發(fā)的電子基態(tài)或者被激發(fā)的發(fā)光態(tài)，則涉及發(fā)光體的能發(fā)光的最小單元即分子、復(fù)合物、缺陷處、量子點(diǎn)或者諸如此類的電子狀態(tài)。
[0006]如果在這里談到光、例如熒光退激發(fā)光的強(qiáng)度分布的局部最小處，則尤其是指強(qiáng)度分布的由干涉所產(chǎn)生的零位置。在此可能涉及真實(shí)的零位置，在該零位置中光的強(qiáng)度實(shí)際上返回到零，或者涉及一種這樣的零位置:在該零位置中光的強(qiáng)度由于缺乏理想的光學(xué)情況而僅基本上返回到零。如果在這里談到局部最小處的大小，則該大小尤其涉及體積的大小，在該體積中，相應(yīng)的光造成通過該光追求的效果，例如通過該光激發(fā)的過渡，不達(dá)到飽和。
【背景技術(shù)】
[0007]一種用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率地成像的方法作為STED(受激輻射耗竭)網(wǎng)柵熒光顯微鏡已知，該方法包括獨(dú)立權(quán)利要求1的前序部分的以上所說明的步驟。試樣在測量區(qū)域中首先被加載以熒光激發(fā)光，所述熒光激發(fā)光將發(fā)光體從可激發(fā)的電子基態(tài)激發(fā)到被激發(fā)的發(fā)光態(tài)。然后，對試樣在測量區(qū)域中加載以呈發(fā)射激勵光形式的、具有局部最小處的熒光退激發(fā)光強(qiáng)度分布，所述發(fā)射激勵光激勵發(fā)光體發(fā)射具有發(fā)射激勵光的波長、即具有與熒光的波長不同的波長的光，并且借此使其又退激發(fā)到其基態(tài)。當(dāng)熒光退激發(fā)光使發(fā)光體從被激發(fā)的發(fā)光態(tài)在局部最小處之外各處通過受激發(fā)射又被退激發(fā)時，接著由測量區(qū)域所發(fā)射的熒光只可能來自熒光退激發(fā)光強(qiáng)度分布的局部最小處，因此能夠?qū)?yīng)于局部最小處在試樣中的位置。
[0008]在以關(guān)鍵詞STED已知的方法中，在試樣的以發(fā)光體標(biāo)記的結(jié)構(gòu)的成像中實(shí)際上也達(dá)到非常高的具有高對比度的地點(diǎn)分辨率。然而在此，發(fā)光體顯著地承受光化學(xué)負(fù)荷并且因此強(qiáng)烈地傾向于褪色。原因在于，熒光退激發(fā)光加載已經(jīng)處于其被激發(fā)的發(fā)光態(tài)下的發(fā)光體，所述熒光退激發(fā)光為了約束其強(qiáng)度分布的呈零位置形式的局部最小處而必須以高的絕對強(qiáng)度施加。因此，除了所想要的使發(fā)光體返回其基態(tài)的被激勵發(fā)射之外，其它的過程、尤其更大程度上的導(dǎo)致褪色的發(fā)光體電子激勵也不是不可能的。也可能由于本來設(shè)置用于熒光退激發(fā)的光而出現(xiàn)由被激勵的發(fā)射首先退激發(fā)的發(fā)光體的重新激發(fā)。
[0009]另一種用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率地成像的方法作為GSD(基態(tài)耗竭，Ground State Deplet1n)網(wǎng)柵焚光顯微鏡已知。在這種已知的方法中，發(fā)光體在被以焚光激發(fā)光加載之前被加載以焚光阻抑光，所述焚光阻抑光具有帶有局部最小處的強(qiáng)度分布。熒光阻抑光使發(fā)光體轉(zhuǎn)換為暗態(tài)、例如長壽命的三重態(tài)，從該暗態(tài)出來，發(fā)光體不被以熒光激發(fā)光激發(fā)到發(fā)光態(tài)。這種向暗態(tài)直至飽和的轉(zhuǎn)換在熒光阻抑光的強(qiáng)度分布的局部最小處之外各處進(jìn)行，即，在被加載以熒光阻抑光之后，發(fā)光體只在熒光阻抑光的強(qiáng)度分布的局部最小處中還處于其電子基態(tài)中，從該電子基態(tài)出發(fā)，發(fā)光體被以熒光激發(fā)光激發(fā)到發(fā)光態(tài)。因此，在以熒光激發(fā)光激發(fā)之后，由發(fā)光體發(fā)射的熒光來自熒光阻抑光的強(qiáng)度分布的局部最小處，因此能夠?qū)?yīng)局部最小處在試樣中的位置。
[0010]在以關(guān)鍵詞GSD已知的方法中，也存在發(fā)光體褪色的巨大風(fēng)險，因?yàn)榘l(fā)光體在其被以熒光阻抑光所轉(zhuǎn)換到的長壽命暗態(tài)中以提高的程度例如傾向于與氧氣化學(xué)反應(yīng)和/或承受這樣的風(fēng)險:發(fā)光體被熒光阻抑光或者熒光激發(fā)光進(jìn)一步激發(fā)，從而發(fā)生發(fā)光體的光化學(xué)褪色。
[0011]另一種用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率地成像的方法作為 RES0LFT(可逆飽和焚光過渡 Reversible Saturable Optical FluorescenceTransit1ns)網(wǎng)柵熒光顯微鏡的變型已知，該RES0LFT網(wǎng)柵熒光顯微鏡使用所謂的可轉(zhuǎn)換的發(fā)光體。所述發(fā)光體可借助于熒光阻抑光從其作為發(fā)光體起作用的第一構(gòu)象狀態(tài)轉(zhuǎn)換到其不作為發(fā)光體起作用的第二構(gòu)象形態(tài)，即，在第二構(gòu)象狀態(tài)中，發(fā)光體至少借助于在第一構(gòu)象狀態(tài)下適合于激發(fā)發(fā)光態(tài)的熒光激發(fā)光不能被激發(fā)到發(fā)光態(tài)，在所述發(fā)光態(tài)下發(fā)光體發(fā)射被作為測量信號記錄的熒光。為了在熒光阻抑光的強(qiáng)度分布的局部最小處之外各處促使這種轉(zhuǎn)換直至飽和，在第二構(gòu)象狀態(tài)壽命足夠長的情況下僅需要相對小的光強(qiáng)度。此外不存在顯著的這種風(fēng)險:被轉(zhuǎn)換到其另一構(gòu)象狀態(tài)的發(fā)光體從該另一構(gòu)象狀態(tài)出來脫色，因?yàn)榘l(fā)光體在該構(gòu)象狀態(tài)下對焚光阻抑光和焚光激發(fā)光不響應(yīng)。
[0012]在具有可轉(zhuǎn)換的發(fā)光體的RES0LFT網(wǎng)柵熒光顯微鏡的實(shí)際應(yīng)用中，觀測地點(diǎn)分辨率和對比度，該地點(diǎn)分辨率和對比度不如在STED網(wǎng)柵熒光顯微鏡中的地點(diǎn)分辨率不如對比度好。這能歸因于，即使可轉(zhuǎn)換的發(fā)光體被促使轉(zhuǎn)換到其不能發(fā)光的構(gòu)象狀態(tài)直至飽和時，始終仍有顯著份額的發(fā)光體還是處于其能發(fā)光的構(gòu)象狀態(tài)中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的任務(wù)是，給出一種用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)的空間高分辨率地成像的方法，在該方法中達(dá)到STED網(wǎng)柵熒光顯微鏡的高地點(diǎn)分辨率和高對比度，然而，發(fā)光體比在STED網(wǎng)柵熒光顯微鏡的所有迄今已知的方法中承受更小的光化學(xué)褪色風(fēng)險。
[0014]本發(fā)明的該任務(wù)通過具有獨(dú)立權(quán)利要求1的特征的方法解決。在從屬權(quán)利要求中限定根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施例。
[0015]在根據(jù)本發(fā)明的、用于試樣的具有發(fā)光體的結(jié)構(gòu)在空間上高分辨率地成像的方法中，執(zhí)行所有對于STED網(wǎng)柵熒光顯微鏡方法來說具有代表性的步驟；即，根據(jù)本發(fā)明的方法涉及STED網(wǎng)柵熒光顯微鏡的特定方法:對試樣在測量區(qū)域中以熒光激發(fā)光加載，所述熒光激發(fā)光將發(fā)光體從可激發(fā)的電子基態(tài)激發(fā)到被激發(fā)的發(fā)光態(tài)。此外，試樣在測量區(qū)域中還被以熒光退激發(fā)光的具有局部最小處的強(qiáng)度分布加載，所述熒光退激發(fā)光將發(fā)光體從被激發(fā)的發(fā)光態(tài)帶回可激發(fā)的電子基態(tài)而不發(fā)射熒光。記錄從測量區(qū)域發(fā)射的熒光；將所記錄的熒光對應(yīng)于所述局部最小處在試樣中的位置。
[0016]在根據(jù)本發(fā)明的方法中，在對試樣在測量區(qū)域中以熒光激發(fā)光加載之前附加地以激發(fā)阻抑光的強(qiáng)度分布加載，所述激發(fā)阻抑光使發(fā)光體從可激發(fā)的電子基態(tài)轉(zhuǎn)換到保護(hù)態(tài)。在保護(hù)態(tài)下，發(fā)光體受保護(hù)以免被熒光激發(fā)光和熒光退激發(fā)光電子激發(fā)。激發(fā)阻抑光的強(qiáng)度分布也具有局部最小處，該局部最小處與焚光退激發(fā)光的強(qiáng)度分布的局部最小處重置。
[0017]因此，根據(jù)本發(fā)明的方法也包括如在由可轉(zhuǎn)換的發(fā)光體所用的RES0LFT網(wǎng)柵熒光顯微鏡方法中使用的那樣的步驟。然而在根據(jù)本發(fā)明的方法中主要不是嘗試:在提高地點(diǎn)分辨率的意義上，通過兩個地點(diǎn)分辨地起作用的強(qiáng)度分布的、具有重合的零位置的強(qiáng)度分布的疊加來改進(jìn)有效地起作用的點(diǎn)成像功能。而是在根據(jù)本發(fā)明的方法中主要充分利用:將發(fā)光體例如在具有可轉(zhuǎn)換的發(fā)光體的RES0LFT方法中在激發(fā)阻抑光的強(qiáng)度