一種丹參多酚酸注射液的含量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物含量檢測方法，尤其是一種丹參多酚酸注射液的含量檢測方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 注射用丹參多酚酸是近幾年開發(fā)的一種新型凍干粉針劑，主要組方為丹參多酚 酸，其配方和制備方法：丹參多酚酸加入甘露醇等輔料和注射用水，經(jīng)活性炭除熱原、微孔 濾膜過濾，再冷凍干燥而得，具有活血、化瘀、通脈之功，用于冠心病穩(wěn)定型心絞痛，分級為 I、II級，心絞痛癥狀表現(xiàn)為輕、中度，中醫(yī)辨證為心血瘀阻證者，癥見胸痛、胸悶、心悸。
[0003]圍繞注射用丹參多酚酸質(zhì)量控制的研宄很多，測定其主要有效成分酚酸主要采用 C18色譜柱，由于甘露醇是一種六元醇極性化合物，不能采用常規(guī)的C18柱進(jìn)行檢測，所以 同時對制劑中主要有效成分和輔料的分析尚未見報道。
[0004]甘露醇為注射用丹參多酚酸的輔料，目前報道的甘露醇的測定方法有碘量法、紫 外-可見分光光度法、HPLC-RID和HPLC-ELSD法等。碘量法與紫外一可見分光光度法需要 經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)，操作繁瑣，難以直接測定甘露醇含量。HPLC-RID法示差折光檢測器靈敏度 低，易受外界影響。HPLC-ELSD法較好，而甘露醇對色譜柱要求較高，C18柱對甘露醇不能檢 測，普通色譜柱難以同時對其多酚酸及輔料甘露醇測定。且色譜法存在不同待測組分在檢 測器上響應(yīng)差異的問題，NMR是一種無偏向性的檢測方法，可以解決這一問題。
[0005]定量質(zhì)子核磁共振（quantitative proton nuclear magnetic resonance, qiH-NMR) 因其獨(dú)特的優(yōu)勢而獲得越來越多的關(guān)注，廣泛應(yīng)用于藥物、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，且我國2010 版藥典將dH-NMR收載在附錄中。c^H-NMR用于藥物分析的最大優(yōu)勢在于可同時提供化合 物結(jié)構(gòu)確證的定性信息和含量測定的定量信息。與HPLC方法相比，核磁共振法具有樣品前 處理簡單、譜圖直觀、耗時短等優(yōu)點(diǎn)，能準(zhǔn)確地檢測出制劑中的有效成分和輔料，為中藥注 射劑含量測定提供了一種新的手段。
[0006]中藥注射劑在制備工藝上往往需要使用一些輔料，例如助溶劑、抗氧劑、pH調(diào)節(jié) 劑、等滲調(diào)節(jié)劑、膨松劑等。近年來中藥注射劑安全問題層出不窮，輔料的安全問題日益受 到關(guān)注。本發(fā)明同時對注射用丹參多酚酸中的有效成分和輔料進(jìn)行定性定量分析，對保證 制劑安全有效具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種丹參多酚酸注射液的含量檢測方法，該 方法可以同時對丹參多酚酸注射液中的迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇的含量進(jìn)行 檢測。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0009]一種丹參多酚酸注射液的含量檢測方法，基于核磁共振法CH-NMR)對注射用丹參 多酚酸中的多種成分同時進(jìn)行含量測定，具體步驟為：
[0010] ⑴內(nèi)標(biāo)溶液的配制
[0011] 稱取1(2冊04、似112?0 4與內(nèi)標(biāo)物TSP(3-三甲基硅基丙酸鈉-d4)于容量瓶中，用 D20(重水）溶解并定容至刻度線，用于所有實(shí)驗(yàn)溶劑；
[0012] ⑵對照品洛液的制備
[0013] 分別精密稱取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇對照品，并分別制成相應(yīng)的對 照品儲備液；
[0014] (3)供試品溶液的制備
[0015] 精密稱取注射用丹參多酚酸凍干粉并加入上述內(nèi)標(biāo)溶液中溶解，其中，每20mg丹 參多酚酸凍干粉加入lml內(nèi)標(biāo)溶液，得供試品溶液，將所述供試品溶液可轉(zhuǎn)移至5_核磁管 中，直接用于 1H- NMR測試；
[0016] (4)屯-匪1?指紋圖譜的測定
[0017] 將核磁管置于核磁共振儀中，采用水峰抑制脈沖序列測定注射用丹參多酚酸樣品 溶液的iH-NMR指紋圖譜和對照品溶液的1H-NMR圖譜，所有的一維屯-匪1?譜均在298K下采 集，脈沖序列zgcppr抑制水峰，譜寬設(shè)置為12335. 5Hz，弛豫延遲時間為20s確保所有信號 完全弛豫，采樣點(diǎn)數(shù)32k，掃描次數(shù)：16次；
[0018] 為對其信號進(jìn)行歸屬，測定指定樣品的2D NMR譜，包括：$-屮COSY/H-1!! T0CSY，屯-13(： HSQC 和1H-13C HMBC 譜；
[0019] (5)樣品1H-NMR圖譜分析
[0020] 依據(jù)NMR譜及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，鑒定迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、甘露醇，采用 MetresNova軟件對得到的屯-匪1?指紋圖譜依次進(jìn)行相位調(diào)整、基線校正、定標(biāo)，并對其信號 進(jìn)行歸屬；
[0021] (6)屯-匪1?多成分的含量測定
[0022] 在上述實(shí)驗(yàn)條件下采集圖譜，對迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸和甘露醇以及內(nèi)標(biāo)物 TSP的定量峰分別進(jìn)行積分，按照1H-NMR內(nèi)標(biāo)法根據(jù)積分結(jié)果依照下式計算樣品的質(zhì)量：
[0024] 其中，ATSP和A s分別是TSP甲基峰和化合物定量峰的積分面積，n TSP和n s分別代 表TSP甲基峰和化合物定量峰的質(zhì)子個數(shù)，WTS^ W s分別是TSP和化合物的質(zhì)量，M ^和M s 分別是TSP和化合物的分子量。
[0025] 優(yōu)選的，上述丹參多酚酸注射液的含量檢測方法，所述步驟（1)中所述內(nèi)標(biāo)溶 液中含有 1. 5M K2HP04、1. 5M NaH2P04、0. 2mg/ml TSP。（例如，精密稱取 K2HP043 . 48 36g、 似1^042.40018與內(nèi)標(biāo)物了5?(3-三甲基硅基丙酸鈉-(1 4)2011^于1001111容量瓶中）。
[0026] 優(yōu)選的，上述丹參多酚酸注射液的含量檢測方法，所述步驟（2)中迷迭香酸、紫草 酸、丹酚酸B和甘露醇對照品分別制成相應(yīng)的對照品溶液，方法如下：分別加所述內(nèi)標(biāo)溶液 制成質(zhì)量濃度為1. 685、1. 235、16. 21、12. 54mg/ml的混合溶液，作為對照品儲備液。
[0027] 優(yōu)選的，上述丹參多酚酸注射液的含量檢測方法，所述步驟（5)中迷迭香酸、丹酚 酸B、紫草酸、甘露醇的信號進(jìn)行歸屬如下表1。
[0028]表1
[0029]
[0031] 本發(fā)明的有益效果是：
[0032] 上述注射用丹參多酚酸的含量檢測方法，由于供試品均為水溶性成分，故選擇重 水為溶劑；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溶液pH值對NMR圖譜有影響，故配制成一定磷酸鹽緩沖液，可以穩(wěn)定 pH值；將制劑樣品溶解于重水磷酸鹽緩沖液中，不加其它任何處理，直接用于NMR測試，操 作簡便，而且可以最大程度反映注射劑的真實(shí)組成。
[0033] 本發(fā)明所述方法可以有效解決丹參多酚酸及賦形劑甘露醇等成分的定量分析問 題，上述方法具有簡便易行、穩(wěn)定性好、精密度高、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，在全面檢測 注射用丹參多酚酸質(zhì)量方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0034] 圖1為注射用丹參多酚酸樣品的一維1H NMR譜，S 2. 5-4. 3和S 5. 7-7. 7部分分 別放大2倍、8倍，其中1是丹酚酸B，2是紫草酸，3是甘露醇，4是迷迭香酸；
[0035]圖2為4種成分迷迭香酸（A)，紫草酸（B)，丹酚酸B (C)，甘露醇（D)用于含量測定 的定量峰圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】 對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 注射用丹參多酚酸1H-NMR標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立
[0039] 1. 1儀器與試藥
[0040] BRUKER AVANCEIII 600型超導(dǎo)核磁共振波譜儀，質(zhì)子激發(fā)頻率600. 23MHz，配置 BBF0正相觀察寬帶探頭。5mm標(biāo)準(zhǔn)核磁樣品管（美國N0RELL公司）。METTLER TOLEDO XP6 天平（瑞士 METTLER公司）。
[0041] D20(氘代度>99.8%，美國N0RELL公司）；3-(三甲基甲硅烷）丙酸-d4鈉鹽 (TSP，氘代度>98%，美國Sigma-Aldrich公司）；迷迭香酸（批號wlO-5-3)、紫草酸（批號 W14-8-0)、丹酚酸B (批號W15-5-7)標(biāo)準(zhǔn)品均購自天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，純度