納米免疫磁珠技術聯(lián)合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測技術領域，具體公開了一種納米免疫磁珠技術聯(lián)合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌的方法，適用于食品中致病菌單增李斯特菌的檢測。
【背景技術】
[0002]
單核細胞增生李斯特菌(Zisteria monocytogenes，簡稱為單增李斯特菌)，是一種人畜共患病致病菌，也是常見的食源性致病菌之一，廣泛存在于肉、蛋、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等食物中，該菌在4°C仍可生長，多次發(fā)生單增李斯特菌污染中毒的事件，它能引起腦膜炎、腸胃炎癥、敗血病、流產(chǎn)等臨床癥狀，尤其對新生兒、孕婦、老年人及免疫力低下人群的危害很大，有很高的致死率，成為食品安全的一大隱患。
[0003]目前，檢測單核增生李斯特氏菌的方法有三種:傳統(tǒng)的生物學分離培養(yǎng)法、分子生物學檢測法、免疫檢測法。其中傳統(tǒng)培養(yǎng)法即國標方法耗時耗力，分子檢測方法價格昂貴，免疫檢測法一般靈敏度達不到要求，均不適合現(xiàn)場大量樣品的快速篩查。
[0004]本研究主要利用多種免疫檢測法相結合來檢測食品中單核增生李斯特氏菌，這種新型的快速檢測方法結合了納米免疫磁珠分離技術和膠體金層析技術，其方法具有快速、靈敏度高，準確率高，低成本、高通量、便攜帶等優(yōu)點，為致病菌檢測指出了新的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]
本發(fā)明主要針對現(xiàn)有的生物檢測方法費時費力、操作過程復雜以及靈敏度不高的缺陷，而提供一種以納米免疫磁珠分離技術聯(lián)合膠體金免疫層析快速檢測單增李斯特菌試紙條制備的方法。從而實現(xiàn)簡便、快速、準確的檢測單增李斯特菌的目的。
[0006]本發(fā)明提出的納米免疫磁珠技術聯(lián)合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌方法，其特征在于:應用鏈霉親和素-生物素介導偶聯(lián)的納米磁珠標記經(jīng)雜交瘤技術制備篩選所得的單增李斯特菌特異性反應鼠系單抗制備成免疫磁珠；同時以膠體金標記的另一抗單增李斯特菌的配對單克隆抗體為標記抗體，選自新西蘭大白兔的抗單增李斯特菌多克隆抗體和羊抗鼠IgG 二抗分別作為檢測線T區(qū)和質控線C區(qū)，經(jīng)過膠體金標記抗體的結合墊、檢測線T區(qū)和質控線C區(qū)的層析膜、吸水墊組建成一種基于雙抗體夾心檢測原理的單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條。檢測樣品時，將免疫磁珠與樣品中的菌體進行特異性的捕獲進富集，再在膠體金免疫層析試紙條的樣品墊上加入其富集液體，依據(jù)膠體金的顏色在檢測線T區(qū)域和質控線C區(qū)域處形成肉眼可見的顯色條帶的判讀，從而實現(xiàn)單增李斯特菌的快速半定量檢測。
[0007]其中所述的抗單增李斯特菌特異性兩株單抗是采用雜交瘤技術制備篩選所得，并且經(jīng)雙抗體夾心ELISA篩選出的配對抗體，所述的抗單增李斯特菌特異性多抗是通過免疫新西蘭大白兔制備所得，兩種抗體具有很高的特異性。
[0008]本發(fā)明所述的納米免疫磁珠的制備步驟如下:
1、抗體的制備與純化:
以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫8周齡健康BALB/c雌性小鼠，按常規(guī)的雜交瘤技術和極限稀釋法制備和篩選單克隆抗體細胞株，進而將抗單增李斯特菌的特異性抗體細胞株增殖培養(yǎng)，注射到小鼠體內(nèi)制備腹水，所得腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進行抗體純化；
以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫新西蘭大白兔，所得抗單增李斯特菌血清經(jīng)硫酸銨沉淀法進行純化，所得多克隆抗體保存于-80度待用；
2、納米磁珠與抗體的偶聯(lián):
將ISOnm磁珠洗滌，采用活潑酯的方法，依次加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)、二氯乙烷(EDC)，置于混勻儀上保持磁珠懸浮狀態(tài)，37 °C活化2h，將活化磁珠與鏈霉親和素偶聯(lián)，獲得的鏈霉親和素磁珠；再將其與生物素化的單增李斯特菌單克隆抗體1B12，置于混勻儀上偶聯(lián)，制成鏈霉親和素免疫磁珠并于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0009]本發(fā)明所述的膠體金試紙條制備步驟如下:
1、膠體金的制備:取0.01%HAuC14水溶液10ml置于燒杯內(nèi)，加熱煮沸時加入2mL 1%梓檬酸三鈉，繼續(xù)加熱煮沸5min,冷卻后加超純水至lOOmL，制得40nm的膠體金溶液；
2、結合墊的處理:將制備出的另一株與磁珠偶聯(lián)單抗1B12配對的抗單增李斯特菌的單克隆抗體3B10標記于膠體金顆粒上，使其終濃度為25 μ g/mL，使之標記液體噴點在結合墊上以備用；
3、層析膜的包被:用自動噴膜儀，以0.9PL/cm的速度，將特定濃度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分別噴點在層析膜的T線和C線處，噴點時線與線間的間隔距離為0.8cm，包被后的層析膜于37°C干燥箱中烘干8小時，置于干燥器中保存?zhèn)溆茫?br> 4、試紙條的組裝與制備:將樣品墊、結合墊、層析膜、吸水墊依次相互交錯約Imm粘貼在襯板上，然后在上層覆蓋密封膜；根據(jù)要求寬度切割即可得到膠體金免疫層析試紙條。
[0010]本發(fā)明所述的納米免疫磁珠捕獲富集菌體方法步驟如下:
取樣品與自制的免疫磁珠在旋轉混合儀上室溫反應，反應后進入磁場分離，經(jīng)重懸、水浴即可得到菌體富集液用于下一步膠體金試紙條的檢測。
[0011]有益效果:
本發(fā)明將納米免疫磁珠分離技術與膠體金免疫層析技術相結合，通過納米磁珠偶聯(lián)抗體，形成免疫磁珠進而來富集捕獲菌體，再將捕獲的菌體進行基于雙抗體夾心原理的膠體金免疫層析試紙條檢測，這種方法具有用時少、準確率高、檢測費用低、不需要專業(yè)操作人員，且靈敏度高，可達50CFU/mL。因此，本方法特別很適于快速篩查單增李斯特菌。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明納米免疫磁珠富集捕獲菌體過程示意圖；
圖2為膠體金免疫層析試紙條原理示意圖；
圖3為采用納米免疫磁珠技術聯(lián)合膠體金免疫層析快速檢測試紙條對單增李斯特菌樣品檢測陽性、陰性、無效的結果是意圖；
圖4為單增李斯特菌培養(yǎng)樣品檢測的結果是示意圖； 圖5為單增李斯特菌模擬污染樣品檢測的結果是示意圖；
圖6為試紙條特異性檢測結果示意圖:
【具體實施方式】
實施案例I免疫磁珠的制備及捕獲單增李斯特菌檢測 1、納米免疫磁珠的制備
(O抗體的制備與純化:以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫8周齡健康BALB/c雌性小鼠，按常規(guī)的雜交瘤技術和極限稀釋法制備和篩選單克隆抗體細胞株，進而將抗單增李斯特菌的特異性抗體細胞株增殖培養(yǎng)，注射到小鼠體內(nèi)制備腹水，所得腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進行抗體純化；以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫新西蘭大白兔，所得抗單增李斯特菌血清經(jīng)硫酸銨沉淀法進行純化，所得多克隆抗體保存于-80度待用。
[0013](2)納米磁珠與抗體的偶聯(lián):采用活潑酯的方法，將鏈霉親和素與180nm磁珠偶聯(lián)獲得鏈霉親和素磁珠，采用生物素化抗體與鏈霉親和素磁珠連接制成鏈霉親和素免疫磁珠。取1mg磁珠依次用無水乙醇，依次用lmol/L NaOH, lmol/L HCl各洗滌I次，用PB (0.02mol/L，ρΗ4.0)洗 5 次 MES (0.05mol/L，ρΗ6.0)重懸。依次加入 N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHSS) 0.4mg，二氯乙烷(EDC) 0.35mg，置于混勻儀上保持磁珠懸浮狀態(tài)，37°C活化2h0將每mg活化磁珠與200 μ g鏈霉親和素偶聯(lián)；獲得的鏈霉親和素磁珠，按每mg磁珠加入80 mg生物素化LM單克隆抗體1B12，置于混勻儀上37°C偶聯(lián)30min。磁力架回收磁珠，PB 洗滌 3 次，1mLPBS (含 0.05g/100mL NaN3，0.5g/100mL BSA, ρΗ7.4)重懸免疫磁珠并于4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0014]2、納米免疫磁珠捕獲富集菌體
(I)免疫磁珠捕獲L M菌液
取I mL 15CFU / mL的LM菌液于2 mL的離心管中，取60 mg/g單克隆抗體/磁珠偶聯(lián)比制備的免疫磁珠0.1 mg于上述離心管，另設對照組。室溫下在Dynal-MIXl旋轉混合儀上反應30 min( 10 r/min)后取下，將離心管插入磁力架分離2 min，吸出上清液。加I mL PB (-0.02%吐溫20)洗滌2遍，分離后吸出洗滌液，最后用I mL PB重懸磁珠，將上清液、洗滌液、磁珠重懸液及對照組作合適倍數(shù)稀釋，取100 μ L涂布于LM選擇性培養(yǎng)基，平行3個樣品。37 °C培養(yǎng)12 h，選擇菌落數(shù)在20?200范圍內(nèi)的進行計數(shù)，按公式計算其捕獲效率(CE):
CE (%) = (C1-C2-C3) /Cl *100%
Cl為對照組菌落總數(shù)，C2為上清液菌落總數(shù)，C3為洗滌液菌落總數(shù)當免疫磁珠添加量達到0.1mg時，I mL 15CFU /mL LM菌液捕獲效率大于99%。為了保證有效分離，確定在檢測中免疫磁珠加入量為0.lmg。圖1為本發(fā)明納米免疫磁珠富集捕獲菌體過程示意圖。
[0015](2)在肉樣中的捕獲效果
稱取25 g市售豬肉切碎置于無菌的三角瓶內(nèi)，添加培養(yǎng)好的LM模擬污染，至目標菌濃度約為12CFU / g，然后加入250 mL EC肉湯，37 °C, 160 r/min搖床培養(yǎng)8 h，取ImL上層清液到離心管里，各添加0.1mg自制的免疫磁珠，在旋轉混合儀上室溫反應30min，結束后放入磁場分離2 min。將對照組、分離上清液、洗滌液、磁珠重懸液作合適倍數(shù)稀釋，取100 μ L涂布于單增李斯特菌選擇性培養(yǎng)基上，(對照組同時涂布瓊脂培養(yǎng)基計算菌落總數(shù))，平行制備3個樣品。37 V培養(yǎng)12 h后，對大單增李斯特菌和雜菌分別計數(shù)，計算捕獲效率。同時，購買商品磁珠進行同一實驗，并計算其捕獲效率。在豬肉樣中的捕獲效果: