一種檢測毒死蜱的適配體傳感器的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于適配體的農(nóng)藥殘留快速檢測方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)藥對農(nóng)業(yè)保持豐收增產(chǎn)起到了很大的作用，其已成為一種重要的生產(chǎn)資料，現(xiàn)在生產(chǎn)領(lǐng)域中應(yīng)用的種類已經(jīng)達(dá)到100多種，被用于防治病、蟲、雜草對農(nóng)作物危害，對促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)有著重要的作用。但是，農(nóng)藥的不合理使用，不僅造成了水環(huán)境、土壤、大氣的污染，也導(dǎo)致了農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，引起人體中毒以及貿(mào)易壁皇。隨著人們生活水平的提高，農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題越來越受到關(guān)注，尤其果品、蔬菜中農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。毒死蜱是目前全世界生產(chǎn)和銷售量最大的殺蟲劑品種之一。毒死蜱是高效中毒的廣譜殺蟲劑兼除草劑，具有一定的內(nèi)吸性，可以通過食物鏈的富集作用轉(zhuǎn)移至人體，對人體具有潛在致癌作用，因此，毒死蜱一直是環(huán)境和食品中農(nóng)藥殘留檢測的重要項(xiàng)目。加強(qiáng)對農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測對保護(hù)生態(tài)環(huán)境以及保障人類健康有著十分深遠(yuǎn)的意義。
[0003]核酸適配體(Aptamer，又稱適配體、適配子)是人工合成的核酸序列，經(jīng)多次篩選獲得的適配體與靶標(biāo)分子有很高的特異性和親和力。適配體的識別特性與抗體相似，又稱“化學(xué)抗體”。與抗體相比，適配體是由體外篩選和擴(kuò)增獲得，不需要免疫動(dòng)物或培養(yǎng)細(xì)胞，具有極好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，很高的純度，可以避免產(chǎn)生批間差異等優(yōu)勢。另外，核酸適配體無免疫原性，可在不同溫度、不同離子濃度、金屬螯合劑存在條件下反復(fù)變性和復(fù)性，在合成過程中，各種報(bào)告分子(熒光素或生物素)和功能集團(tuán)可精確地結(jié)合在適配體位點(diǎn)上。目前用抗體進(jìn)行檢測和診斷的技術(shù)幾乎可以全部由適配體來代替。因此本文嘗試制備一種檢測毒死蜱殘留的適配體傳感器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種基于上述優(yōu)點(diǎn)以及操作簡單、靈敏度高、選擇性好的檢測毒死蜱農(nóng)藥殘留的適配體傳感器制備方法。采取的技術(shù)方案為:
一種檢測毒死蜱殘留的適配體傳感器的制備方法，其特征在于，是在經(jīng)過清洗、活化和性能測試的裸玻碳電極表面滴涂介孔碳-殼聚糖復(fù)合液，然后用二茂鐵-多壁碳納米管進(jìn)行修飾，再在修飾后的電極上固定毒死蜱適配體，最后用牛血清蛋白封閉，得到檢測毒死蜱的適配體傳感器。
[0005]所述方法的步驟如下:
1)清洗、活化并測試裸玻碳電極，獲得預(yù)處理玻碳電極；
2)制備介孔碳-殼聚糖復(fù)合液；
3)將步驟2)制備的介孔碳-殼聚糖復(fù)合液滴涂到步驟1)的預(yù)處理玻碳電極上，分散均勻后，利用二茂鐵-多壁碳納米管進(jìn)行修飾，得到修飾電極；
4)在步驟3)所得的修飾電極上固定毒死蜱的適配體，獲得固定電極； 5)用牛血清蛋白封閉步驟4)所得的固定電極，得到毒死蜱適配體傳感器。
[0006]所述方法步驟1)所述清洗、活化并測試裸玻碳電極是利用熱piranha溶液浸泡裸玻碳電極后，用A1203漿拋光，再依次用去離子水、ΗΝ03、無水乙醇和去離子水超聲清洗，干燥后用循環(huán)伏安法活化，并通過檢測裸電極循環(huán)伏安曲線峰電位差測試裸電極。
[0007]所述方法步驟2)所述制備介孔碳-殼聚糖復(fù)合液，是稱取2 mg有序介孔碳溶于4 ml 0.2%殼聚糖溶液中，在超聲波清洗機(jī)中超聲1小時(shí)，得到均一、淺黑色的懸濁液，得到介孔碳-殼聚糖復(fù)合液。
[0008]所述方法步驟3)所述在預(yù)處理電極表面上滴涂介孔碳-殼聚糖復(fù)合液，是取6yL分散均勻的介孔碳-殼聚糖復(fù)合液滴涂在電極表面，26°C下靜置3h，然后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈伞?br>[0009]所述方法步驟3)所述利用二茂鐵-多壁碳納米管進(jìn)行修飾，是指取6 μ L 二茂鐵-多壁碳復(fù)合物滴涂在電極上，26°C下靜置2h，然后用pH7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈伞?br>[0010]所述方法步驟4)所述固定毒死蜱的適配體，是將修飾電極沉浸在毒死蜱適配體溶液中，4° C條件下浸泡8 h，取出后用PBS緩沖液沖洗表面，晾干待用。
[0011]所述方法步驟5)所述用牛血清蛋白封閉固定電極，是指將固定電極浸入0.5%的BSA溶液中26 °C下靜置2 ho
[0012]所述方法的具體步驟如下:
1)利用熱piranha溶液浸泡裸玻碳電極后，用A1203漿拋光，再依次用去離子水、ΗΝ03、無水乙醇和去離子水超聲清洗，干燥后用循環(huán)伏安法活化，并通過檢測裸電極循環(huán)伏安曲線峰電位差測試裸電極，獲得預(yù)處理電極；
2)制備介孔碳-殼聚糖復(fù)合液，是稱取2mg有序介孔碳溶于4 ml 0.2%殼聚糖溶液中，在超聲波清洗機(jī)中超聲1小時(shí)，得到均一、淺黑色的懸濁液，得到介孔碳-殼聚糖復(fù)合液；
3)在預(yù)處理電極表面上滴涂介孔碳-殼聚糖復(fù)合液，是取6yL分散均勻的介孔碳-殼聚糖復(fù)合液滴涂在電極表面，26°C下靜置3h，然后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈?，再?yL 二茂鐵-多壁碳復(fù)合物滴涂在電極上，26°C下靜置2h，然后用PH7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈桑?br> 4)將步驟3)修飾所得電極沉浸在毒死蜱適配體溶液中，4°C條件下浸泡8 h，取出后用PBS緩沖液沖洗表面，晾干待用；
5)將步驟4)固定所得電極固定電極浸入0.5%的BSA溶液中26 °C下靜置2 h。
[0013]所述一種檢測毒死蜱的適配體傳感器的制備，其特征在于:適配體傳感器的敏感界面組成包括介孔碳-殼聚糖復(fù)合物和二茂鐵-多壁碳復(fù)合物，進(jìn)而固定毒死蜱的適配體。
[0014]所述一種檢測毒死蜱的適配體傳感器的制備，其特征在于:玻碳電極(d=3mm)的清洗，適配體傳感器敏感界面的構(gòu)建及過程表征(制備介孔碳-殼聚糖復(fù)合物復(fù)合材料及二茂鐵-多壁碳復(fù)合材料并以殼聚糖作為分散劑進(jìn)行分散，利用介孔碳-殼聚糖及二茂鐵-多壁碳的協(xié)同作用共同修飾電極)，適配體傳感器工作曲線的建立，適配體傳感器性能的檢測，適配體傳感器對實(shí)際樣品的檢測。
[0015]所述一種檢測毒死蜱的適配體傳感器的制備，其特征在于:實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，主要包括適配體濃度、孵育時(shí)間；所制備的適配體傳感器的工作曲線為A I =1.424 LgC (ng/mL)+24.18 (R2 = 0.996，1_105 ng/mL);適配體傳感器性能檢測包括特異性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、再生性以及免疫傳感器對蔬菜樣品回收率的測定。
[0016]其制備原理為:適配體傳感器以核酸適配體生物分子作為識別元件，通過固定化技術(shù)將核酸分子結(jié)合到感受器表面，發(fā)生特異性識別反應(yīng)后，生成的復(fù)合物與產(chǎn)生的物理或化學(xué)信號相關(guān)聯(lián)，由換能器將其轉(zhuǎn)化為與待測物質(zhì)濃度(或活度)有關(guān)的可定量或者可處理的物理化學(xué)信號，再經(jīng)過二次儀表放大并且輸出信號，從而實(shí)現(xiàn)對待測物質(zhì)的檢測。本發(fā)明采用以殼聚糖作為分散劑制備的介孔碳-殼聚糖復(fù)合物和二茂鐵-多壁碳納米管對玻碳電極進(jìn)行修飾。介孔碳具備大比表面積、均勻孔徑分布、物理化學(xué)性能穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。二茂鐵又名二環(huán)戊二烯合鐵(Fc)，具有獨(dú)特的夾心型結(jié)構(gòu)，二價(jià)鐵離子被夾在兩個(gè)平面環(huán)之間互為交錯(cuò)構(gòu)型。它具有親油性、氧化還原可逆性、芳香性、低毒性、疏水性等特點(diǎn)，所以具有非常好的電化學(xué)活性和電催化功能。殼聚糖(CS)屬于多糖類，它具有優(yōu)異的成膜性、吸附性、透氣性和滲透性，成膜后具有很好的吸附性、穩(wěn)定性和良好的生物相容性，其豐富的氨基、多孔性結(jié)構(gòu)使它被廣泛用于生物分子的固定和修飾電極的制備。殼聚糖的良好成膜性為適配體在電極表面的固定提供了一個(gè)良好的生物界面，保持了適配體的生物活性以用來和農(nóng)藥進(jìn)行有效的特異性結(jié)合。此外，壁碳納米管(MWCNTs)具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)如低密度、高比模量、高強(qiáng)度、良好的電導(dǎo)性和溫度傳導(dǎo)性能，可促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)中電子的傳遞，進(jìn)而增大適配體傳感器的響應(yīng)電流。采用本發(fā)明制成的適配體傳感器可以在蔬果采收、上市前，進(jìn)行農(nóng)藥殘留的快速測定，直接對農(nóng)藥殘留量是否超標(biāo)進(jìn)行檢測，避免因食用含有殘留農(nóng)藥的蔬果而引起中毒，為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)與消費(fèi)提供殘留檢測的技術(shù)支撐。
[0017]為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種檢測毒死蜱的適配體傳感器的制備，其特征在于:(1)適配體傳感器制備前裸玻碳電極的清洗、活化和性能測試，如果測試循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在120 mV以下，氧化峰和還原峰對稱，則所述玻碳電極可使用，否則要重新返回清洗步驟中，直到符合要求。(2)清洗好的裸玻碳電極表面滴涂分散均勻的介孔碳-殼聚糖復(fù)合物，繼而修飾二茂鐵-多壁碳納米管復(fù)合材料，然后固定毒死蜱核酸適配體，最后用牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。適配體傳感器制備結(jié)束后，放入冰箱里4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0018]為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種檢測毒死蜱的適配體傳感器的制備，其特征在于:(1)將上述制備好的適配體傳感器在工作底液中以不同的掃速做循環(huán)伏安方法掃描，可以得到峰值和掃速的關(guān)系，得到是受擴(kuò)散控制的；(2)配置一系列的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到抑制率，進(jìn)一步得出上述制備的適配體傳感器的工作曲線、檢測范圍和檢測限；(3)配置一系列經(jīng)?；旌鲜褂玫霓r(nóng)藥溶液，以檢測所制備適配體傳感器的選擇性；(4)通過循環(huán)伏安掃描多段并且于冰箱中放置一段時(shí)間再次測量驗(yàn)證上述適配體傳感器的穩(wěn)定性，通過解離和再次檢測其再生性能；(5)對實(shí)際果蔬樣品進(jìn)行分析得出該適配體傳感器的回收率。
[0019]本發(fā)明制備的介孔碳-殼聚糖復(fù)合物，以具有良好生物相容性和成膜性的殼聚糖作為分散劑進(jìn)行分散，得到的納米復(fù)合物膜能夠促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)中電子的傳遞，提高電極上的響應(yīng)電流，用以制備響應(yīng)信號強(qiáng)和靈敏度高的適配體傳感器；具有大量氨基的納米復(fù)合膜與二茂鐵-多壁碳納米管復(fù)合材料形成的體系具有較高的穩(wěn)定性和高度有序性，增大適配體傳感器的電流響應(yīng)，并且改善電極表面的微環(huán)境，提高了傳感器表面抗體的有效固定，從而增大了檢測精度。
[0020]所述免疫傳感器的制備工藝如下:(1)取6 μ L分散均勻的介孔碳-殼聚糖復(fù)合膜滴涂在預(yù)處理好的玻碳電極表面，常溫下靜置3 h，用ρΗ7.5的PBS沖洗電極表面；(2)電極表面晾干后，取6 μ L二茂鐵-多壁碳納米管復(fù)合材料滴涂在電極表面，常溫下靜置2 h，然后用PH7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈桑?3)將