鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法，該技術(shù)可直接應(yīng)用于羊及其他動(dòng)物肌肉的生物化學(xué)研究。
【背景技術(shù)】
[0002]醫(yī)學(xué)等生命科學(xué)研究領(lǐng)域通常是通過同位素標(biāo)記法檢測(cè)生物體內(nèi)鈣蛋白酶的磷酸化水平，但同位素標(biāo)記檢測(cè)的方法繁瑣，且對(duì)人體的潛在傷害很大。但是，對(duì)于磷酸化鈣蛋白酶的生化變化進(jìn)行研究分析，以及對(duì)其他動(dòng)物肌肉生理生化的研究來說，鈣蛋白酶的磷酸化是科學(xué)研究中必不可少的。雖然現(xiàn)有技術(shù)中也有針對(duì)蛋白酶磷酸化水平測(cè)定的較為安全的方式，但是由于鈣蛋白酶較為敏感，極易受外界環(huán)境影響，導(dǎo)致活性降低甚至失活等特性。故此，目前還沒有專門針對(duì)鈣蛋白酶磷酸化水平檢測(cè)的方法。因此，一種對(duì)人體安全、檢測(cè)快速準(zhǔn)確地測(cè)定鈣蛋白酶的磷酸化的方法是亟需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。
[0004]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種鈣蛋白酶粗樣品的提取方法，通過本發(fā)明的組織裂解液提取的蛋白樣品中鈣蛋白酶的含量較高、活性較高，解決了在磷酸化水平測(cè)定過程中鈣蛋白酶容易部分失活或全部失活的問題。
[0005]本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供一種鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法，本發(fā)明通過利用蛋白免疫沉淀和蛋白免疫技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定，解決了現(xiàn)有方法中測(cè)定磷酸化水平時(shí)對(duì)人體危害較大和操作過程繁瑣等問題。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0007]一種鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法，包括:
[0008]步驟一、將含有鈣蛋白酶的蛋白樣品的蛋白濃度調(diào)至5.83?12.5 μ g/ μ 1，之后向其中加入磷酸化抗體，所述磷酸化抗體與所述含有鈣蛋白酶的蛋白樣品中的蛋白的總反應(yīng)量的質(zhì)量比為1:1750?2500，然后將含有鈣蛋白酶的蛋白樣品與磷酸化抗體于4°C下震蕩孵育，以形成免疫復(fù)合物，再通過蛋白質(zhì)免疫沉淀方法富集得到磷酸化的鈣蛋白酶樣品；以及，
[0009]步驟二、通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測(cè)所述步驟一中得到的所述磷酸化的鈣蛋白酶樣品的磷酸化水平。
[0010]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法中，所述步驟一中，通過蛋白質(zhì)免疫沉淀方法富集得到所述磷酸化的鈣蛋白酶樣品的具體步驟包括:
[0011]1.1)取Protein A/G瓊脂糖樹脂楽液并使其吸附在離心柱上，其中，所述ProteinA/G瓊脂糖樹脂漿液與所述鈣蛋白樣品的體積比為2?3:40?60，且每個(gè)離心柱內(nèi)加入的所述Protein A/G瓊脂糖樹脂漿液的體積為20-30 μ 1 ;
[0012]1.2)將所述免疫復(fù)合物加入經(jīng)過步驟1.1)處理后的吸附有所述Protein A/G瓊脂糖樹脂的所述離心柱中，并于4°C恒溫震蕩孵育lh，之后離心，然后使用IP洗滌緩沖液洗滌所述Protein A/G瓊脂糖樹脂三次，再用IP條件緩沖液洗滌所述Protein A/G瓊脂糖樹脂一次，最后所述離心柱上截留的即為鈣蛋白酶、磷酸化抗體和Protein A/G瓊脂糖樹脂的三元復(fù)合物；和，
[0013]1.3)向步驟1.2)中截留有所述三元復(fù)合物的所述離心柱中添加還原性上樣緩沖液，并于100°C下孵育5min，冷卻后在室溫下lOOOOXg離心lmin，所得的流穿液體即為富集的所述磷酸化的鈣蛋白酶樣品。
[0014]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法中，所述步驟二中，在通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測(cè)所述磷酸化的鈣蛋白酶樣品的磷酸化水平過程中，與所述鈣蛋白酶反應(yīng)的第一抗體采用μ -calpain單克隆抗體，所述第一抗體的濃度為1.4-2 μ g/ml。
[0015]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法中，所述步驟二中，在通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測(cè)所述磷酸化的鈣蛋白酶樣品的磷酸化水平過程中，與所述第一抗體結(jié)合的第二抗體采用ant1-mouse IgG，所述第二抗體的濃度為0.1-0.3 μ g/ml。
[0016]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法中，在所述步驟一之前還包括提取所述含有鈣蛋白酶的蛋白樣品的方法:
[0017]采集動(dòng)物肌肉樣品，并按照質(zhì)量體積比1:6將所述動(dòng)物肌肉樣品加入組織裂解液或者肌漿抽提液中，將所述動(dòng)物肌肉樣品和所述組織裂解液于冰上勻漿至所述動(dòng)物肌肉樣品和所述組織裂解液形成均一的勻漿液，然后將所述勻漿液于4°C下離心收集上清液即得到所述含有鈣蛋白酶的蛋白樣品；且所有步驟均在冰上操作或冰浴操作；
[0018]其中，所述組織裂解液包含濃度為25mM的N- 二甘氨酸和150mM的氯化鈉，所述組織裂解液的pH為7.6 ;
[0019]所述肌漿抽提液包含濃度為lOOmM的Tris base、10mM的EDTA和0.05%的巰基乙醇，所述肌漿抽提液的pH為8.3。
[0020]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法中，所述組織裂解液中還包含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，且所述磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑均需現(xiàn)用現(xiàn)加；
[0021]所述勻漿過程在冰上共進(jìn)行30s，且每次勻漿時(shí)間為10s，每?jī)纱蝿驖{之間間隔20so
[0022]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法中，所述步驟一中，所述磷酸化抗體和所述含有該蛋白酶的蛋白樣品的總體積為400-600 μ 1，所述含有鈣蛋白酶的蛋白樣品中蛋白的總反應(yīng)量為3500-5000 μ go
[0023]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法中，所述步驟一中，所述磷酸化抗體的濃度為0.2-0.3 μ g/ μ 1，所述磷酸化抗體采用磷酸化絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸泛抗單克隆抗體。
[0024]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法中，所述步驟一中，所述含有鈣蛋白酶的蛋白樣品與磷酸化抗體于4°C下震蕩孵育2_14h，以形成所述免疫復(fù)合物。
[0025]優(yōu)選的是，所述的鈣蛋白酶磷酸化水平的測(cè)定方法中，所述動(dòng)物肌肉樣品取自羊。
[0026]本發(fā)明至少包括以下有益效果:
[0027]本發(fā)明的方法通過蛋白質(zhì)免疫沉淀和免疫印跡技術(shù)同樣可以在宰后肌肉中檢測(cè)出磷酸化的鈣蛋白酶，所需的肌肉樣品量少，操作過程較為簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，檢測(cè)所得條帶清晰，試驗(yàn)方法對(duì)人體的潛在傷害小，是一種高效測(cè)定宰后肌肉中μ -calpain磷酸化水平的方法。利用該方法可對(duì)羊骨骼肌中磷酸化鈣蛋白酶的生化變化進(jìn)行研究分析，也可延伸至其他動(dòng)物肌肉生理生化的研究。
[0028]本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中4-氯-1-萘酚顯色法后的成像圖；
[0030]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中ECL顯色法后的曝光成像圖；
[0031 ]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中的ECL顯色法后的PVDF膜成像圖；
[0032]圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中的ECL顯色法后的曝光成像圖；
[0033]圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中的ECL顯色法后的曝光成像圖；
[0034]圖6為本發(fā)明實(shí)施例5中的ECL顯色法后的曝光成像圖；
[0035]圖7為本發(fā)明實(shí)施例5中曝光成像圖的Quantity One軟件分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0037]應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。
[0038]本發(fā)明中用到的試劑和試劑盒:
[0039]組織裂解液:25mM N_ 二甘氨酸，150mM氯化鈉，添加磷酸酶抑制劑(Roche，每10ml添加1片)和蛋白酶抑制劑(Roche，每50ml添加1片)，pH 7.6 ;
[0040]肌漿抽提液:lOOmMTris base，10mM EDTA，0.05%巰基乙醇，ρΗ8.3[0041 ]磷酸化抗體:phospho-Ser/Thr/Tyr antibody, Abeam abl5556:
[0042]2X 還原性上樣緩沖液:10% SDS 4mL，甘油 2mL，0.5M Tris-HCl pH6.82mL，1M DTT2.0mL，溴酸藍(lán) 0.0lg:
[0043]8% 的分離膠:雙蒸水 4.68ml，1.5M Tris-Hcl pH8.82.5ml, 10% SDS 100 μ 1，30% Acr-Bis(37.5:1)2.67ml，TEMED 5 μ 1，10%過硫酸銨 50 μ 1 ；
[0044]4% 的濃縮膠:雙蒸水 3.05ml，0.5Μ Tris-HCl (pH6.8) 1.25ml, 10 % SDS 50 μ 1,30% Acr-Bis(37.5:1)0.65ml，TEMED 5 μ 1，10%過硫酸銨 25 μ 1 ；
[0045]TBS 緩沖液:Tris 1.21 lg，NaCl 8.76g，lmol/L 的 HC1 調(diào) pH 至 7.5 ;
[0046]封閉液中包含:TBS50ml/L，Tween2025 μ 1/L，BSA 1.5g/L:
[0047]TBST1:每 500mLTBS 加 0.5mL Tween20 ；
[0048]