一種抗gp210抗體檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫診斷領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種抗gp210抗體檢測(cè)試 劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自身免疫性肝病是一類原因不明的慢性肝病，主要包括3種與自身免疫密切相關(guān) 的，W肝、膽損傷為主的疾?。鹤陨砻庖咝愿窝?Autoimmunehepatitis;AIH)、原發(fā)性膽汁 性肝硬化（Primarybiliarycirrhosis;PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎（PrimaiT scleroticcholangitis;PSC)，自身免疫性肝病的診斷主要依靠病史、臨床表現(xiàn)、體征和 實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。每種自身免疫性肝病都具有特征性自身抗體譜，自身抗體檢測(cè)對(duì)自身免 疫性肝病的診斷、分型及鑒別診斷具有重要意義。近年來，國外對(duì)自身免疫性肝病相關(guān)自身 抗體譜祀抗原性質(zhì)、臨床診斷應(yīng)用價(jià)值(尤其是無癥狀期的早期診斷）、疾病臨床特點(diǎn)及活 動(dòng)性的關(guān)系等方面研究進(jìn)展迅速。
[0003] 抗即210(Glucop;rotein210)抗體的祀抗原為位于核孔復(fù)合物上的210KD跨膜糖 蛋白，所識(shí)別的表位是gp210簇基末端上的15個(gè)氨基酸殘基。該自身抗體被一致認(rèn)為是PBC 的高度特異性抗體。Wgp210抗原決定簇的重組蛋白或合成多膚作為抗原，應(yīng)用免疫印跡法 或化ISA法檢測(cè)抗即210抗體，其診斷PBC的特異性可高達(dá)99%，敏感性為10%~41 %。約1/4 (10%~40% )的PBC患者中，抗即210抗體可與ΑΜΑ同時(shí)出現(xiàn)，抗即210抗體也存在于20%~ 47 %ΑΜΑ陰性的PBC患者中?？筭p210抗體的存在及抗體滴度一般不隨患者診斷的時(shí)間及臨 床過程而變化，但抗體陽性與陰性患者的預(yù)后有顯著性差異，陽性患者死于肝衰竭者明顯 多于陰性者?？筭p210抗體可能作為一種獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，陽性提示患者預(yù)后不良。
[0004]對(duì)于抗gp210抗體的檢測(cè)方法主要為間接免疫巧光法和酶聯(lián)免疫吸附法，但運(yùn)些 方法都存在著不足之處： 一、間接免疫巧光法 該法的基本原理是用特異性的抗體與切片中的抗原結(jié)合后，繼用間接巧光抗體，與前 面的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗原抗體巧光復(fù)合物。在巧光顯微鏡下，根據(jù)復(fù)合物的發(fā)光 情況來確定所檢測(cè)的抗原。該方法評(píng)價(jià)：由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的巧光素抗體增多， 發(fā)出的巧光亮度強(qiáng)，因而其敏感性強(qiáng)。但是其不足也是明顯的： (1)運(yùn)用此法是可能出現(xiàn)假陽性。
[0005] (2)在分析結(jié)果時(shí)無法根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識(shí)別。
[0006] (3)操作相對(duì)復(fù)雜，需要價(jià)格較昂貴的巧光顯微鏡，在很多基層醫(yī)院難W推廣，也 不太適用于標(biāo)本量較多的實(shí)驗(yàn)室。
[0007](4)巧光測(cè)定中的本底較高，巧光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。
[000引巧)結(jié)果判定需要有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員，分析結(jié)果的客觀性不足。
[0009]二、酶聯(lián)免疫吸附法 ELISA檢測(cè)抗gp210抗體，簡(jiǎn)便易行，特異性高，與間接免疫巧光法聯(lián)合檢測(cè)，可為臨床 對(duì)PBC的診斷和治療提供更為客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但與其他生物檢測(cè)或免疫檢測(cè)比較，運(yùn)種ELISA檢測(cè)方法、技術(shù)、工具或產(chǎn)品仍有較多的不足而使其應(yīng)用受限，運(yùn)些不足主要包括W 下幾個(gè)方面： (1)檢測(cè)試劑在檢測(cè)過程中為開放方式，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢 測(cè)結(jié)果； (2化LISA方法多采用辣根過氧化物酶進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)范圍和靈敏度都較低。
[0010] (3化LISA方法的檢測(cè)時(shí)間通常反應(yīng)是一件較長，完成一個(gè)測(cè)試所需的總時(shí)間一般 在2個(gè)小時(shí)W上，不能完全滿足臨床上的快速診斷的需求。
[0011] (4化LISA方法不能隨機(jī)進(jìn)樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果存在滯后性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種抗gp210抗體檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法， 具有穩(wěn)定性好，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
[0013] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種抗gp210抗體檢測(cè) 試劑盒，包括生物素化gp210抗原、AP-抗人IgG抗體、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、磁微粒試劑、化學(xué)發(fā)光 底物和清洗液，所述生物素化gp210抗原為偶聯(lián)有生物素的gp210抗原，所述AP-抗人IgG抗 體為堿性憐酸酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，所述磁微粒試劑為表面有親和素的納米磁微粒懸浮 液。
[0014] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述生物素化gp210抗原是生物素與gp210抗原分子 表面的-N出基團(tuán)反應(yīng)得到的。
[0015] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述AP-抗人IgG抗體是堿性憐酸酶AP與抗人IgG抗 體偶聯(lián)得到的。
[0016] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述磁微粒試劑中所述磁微粒的直徑為0.1-0.5μηι， 所述磁微粒具有超順磁性。
[0017] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述校準(zhǔn)品由含抗gp210抗體IgG的人血清配制而 成，用于得到校準(zhǔn)曲線。所述質(zhì)控品由含抗gp210抗體IgG的人血清配制而成。所述清洗液為 清洗濃縮液。
[0018] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述化學(xué)發(fā)光底物中包括3-(2-螺旋金剛燒)-4-甲 氧基-4- (3-憐氧酷)-苯基-1，2-二氧環(huán)乙燒二鋼鹽AMPPD。
[0019] 提供一種用抗gp210抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的方法，包括步驟為:將樣本與磁微粒試 劑、生物素化gp210抗原混勻得到第一復(fù)合物，對(duì)所述第一復(fù)合物進(jìn)行洗涂，再加入AP-抗人 IgG抗體混勻，得到第二復(fù)合物，對(duì)所述第二復(fù)合物進(jìn)行洗涂，再加入化學(xué)發(fā)光底物，測(cè)定發(fā) 光結(jié)果。
[0020] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述方法包括步驟為:將樣本與磁微粒試劑、生物素 化gp210抗原混勻，在37°C下解育15min，得到第一復(fù)合物，對(duì)所述第一復(fù)合物洗涂3次，再加 入AP-抗人IgG抗體，混勻并在37°C下解育15min，得到第二復(fù)合物，對(duì)所述第二復(fù)合物洗涂3 次，再加入化學(xué)發(fā)光底物，混勻并在37°C下解育5min，測(cè)定發(fā)光結(jié)果。
[0021 ]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的抗gp210抗體檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，采用全自 動(dòng)磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，選取堿性憐酸酶AP-金剛燒AMPPD體系，具有穩(wěn)定性好，靈敏度 高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，完成一個(gè)測(cè)試所需的總時(shí)間近在50分鐘W內(nèi)，而且操作簡(jiǎn)易方便，真正實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)全自動(dòng)化。
【附圖說明】
[0022] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可W根據(jù)運(yùn)些附圖獲得其它 的附圖，其中：抗gp210抗體檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法 圖1是本發(fā)明抗gp210抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的原理圖； 圖2是本發(fā)明抗gp210抗體試劑盒的實(shí)際檢測(cè)濃度與理論濃度的線性回歸圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施 例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0024] 實(shí)施例一. 提供一種抗即210抗體檢測(cè)試劑盒，包括生物素化即210抗原（R1