一種快速檢測犬細(xì)小病毒抗體血凝抑制效價的膠體金試紙條、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種快速檢測犬細(xì)小病毒抗體血凝抑制效價 的膠體金試紙條、試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 犬細(xì)小病毒(化nine Parvovirus，CPV)屬細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，是自主復(fù)制型 單鏈DNA病毒，直徑約22nm，呈二十面體立體對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜，殼粒32個。CPV能引起犬的急 性、接觸性、高度致死性傳染病，臨床W劇烈嘔吐、出血性腸炎或非化脈性屯、肌炎和白細(xì)胞 顯著減少為主要特征，有兩種臨床表現(xiàn)型，出血性腸炎型和屯、肌炎型。W幼犬最易感，發(fā)病 率為50~100%，病死率在10~50%，是危害寵物犬、警犬W及其他犬科動物最重要病原之 一。1982年我國首次報道了該病，隨后在東北、華北和西南等地區(qū)的警犬和良種犬中陸續(xù)發(fā) 生和蔓延。2001年該病廣泛流行，造成了極大的損失。我國2008年修訂的《一、二、Ξ類動物 疫病病種名錄》將犬細(xì)小病毒病列為Ξ類動物疫病。
[0003] 疫苗免疫是預(yù)防該病的重要措施，而血凝抑制化I)效價是評價免疫效果的重要指 標(biāo)，HI效價達(dá)到1:80時可W耐受CPV的攻擊。目前市場上已有的CPV抗體檢測膠體金試紙條 W及其他檢測CPV抗體的方法如ELISA試劑盒僅能測血清抗體是否陽性，而無法檢測其抗體 HI效價，因此無法確切評價疫苗免疫效果。血凝抑制試驗作為檢測CPV抗體的一種經(jīng)典實驗 室方法，亦是國家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 14926.57-2008)，但該試驗的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性與CPV的毒 株、紅細(xì)胞的來源、反應(yīng)溫度、緩沖體系及其抑值等多種因素密切相關(guān)，不易被操作者所掌 握，加之試驗所需材料一一豬紅細(xì)胞采集、處理、保存問題，試驗步驟繁瑣等因素嚴(yán)重影響 了該試驗方法的廣泛應(yīng)用。
[0004] 膠體金免疫層析法（Colloidal gold immunochromatogra地y assay,CGIA)是由 固相酶免疫測定技術(shù)發(fā)展而來的固相標(biāo)記免疫測定的新技術(shù)。該方法具有使用方便快速， 便于基層使用和現(xiàn)場使用；成本低，不需要特殊的儀器設(shè)備;結(jié)果讀取直觀等優(yōu)點，已成為 當(dāng)前動物疫病檢測領(lǐng)域中廣泛采用的免疫學(xué)檢測方法之一。
[0005] 目前，尚未有簡便、快速的膠體金試紙條可用于犬血清中CPV抗體HI效價的測定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 根據(jù)上述領(lǐng)域的需求和不足，本發(fā)明提供一種快速檢測犬細(xì)小病毒抗體血凝抑制 效價的膠體金試紙條、試劑盒及檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[000引一種快速檢測犬細(xì)小病毒抗體血凝抑制效價的膠體金試紙條，其特征在于，在膠 體金標(biāo)記物墊上噴有膠體金標(biāo)記的CPV治療性單克隆抗體，即Au-McAb;在檢測線T線上同樣 包被有CPV治療性單克隆抗體McAb;對照線C線上包被羊抗鼠 IgG，所述CPV治療性單克隆抗 體為血凝相關(guān)單克隆抗體。
[0009] 在所述膠體金標(biāo)記物墊上噴的膠體金標(biāo)記的CPV治療性單克隆抗體的濃度為1-10 μg/ml;在所述檢測線T線上包被的CPV治療性單克隆抗體McAb的濃度為0.5-2mg/ml;所述對 照線C線上包被羊抗鼠 IgG的濃度為0.5-2mg/ml。
[0010] 所述檢測線T線上包被的CPV治療性單克隆抗體McAb與所述對照線C線上包被羊抗 鼠 IgG的濃度比值為2:1。
[0011] 在所述膠體金標(biāo)記物墊上噴的膠體金標(biāo)記的CPV治療性單克隆抗體的濃度為3.72 μg/ml;在所述檢測線T線上包被的CPV治療性單克隆抗體McAb的濃度為Img/ml;所述對照線 C線上包被羊抗鼠 IgG的濃度為0.5mg/ml。
[0012] 檢測時將犬血清從1:10開始倍比稀釋，使用16抗原單位的標(biāo)準(zhǔn)抗原時，CGIA效價 乘W4即為犬血清中抗體HI效價;使用32抗原單位的標(biāo)準(zhǔn)抗原時，CGIA效價乘W8即為HI效 價;使用8抗原單位的標(biāo)準(zhǔn)抗原時，CGIA效價乘W2即為HI效價;使用4抗原單位的標(biāo)準(zhǔn)抗原 時，CGIA效價等于HI效價。
[OOU]檢測時可使用32、16、8和4個抗原單位的標(biāo)準(zhǔn)抗原。
[0014] 上述的膠體金試紙條，其特征在于，反應(yīng)時間為10-30min，反應(yīng)溫度為37±2°C，膠 體金溶液的抑值為8.2。
[0015] 本發(fā)明還請求保護(hù)包括上述的膠體金試紙條的試劑盒。
[0016] 本發(fā)明還請求保護(hù)使用上述的膠體金試紙條檢測犬血清中CPV抗體HI效價的方 法。本發(fā)明設(shè)及的一種CPV治療性單克隆抗體，由雜交瘤細(xì)胞(保藏號CGMCC No. 4304)分泌、 制備腹水并純化而得。
[0017] 上述單克隆抗體在CPV抗體HI效價檢測中的應(yīng)用。其特征在于，CPV的結(jié)構(gòu)特點是 立體對稱的，因此存在多個相同的抗原表位，可同時結(jié)合兩個W上相同的單抗;在膠體金標(biāo) 記物墊上噴有膠體金標(biāo)記的CPV治療性單克隆抗體，即Au-McAb，反應(yīng)膜檢測線(T線)上同樣 包被CPV治療性單克隆抗體McAb，而對照線(C線)上包被羊抗鼠 IgG;檢測時，先將樣本倍比 稀釋后與CPV標(biāo)準(zhǔn)抗原等體積混合，稀釋樣本中抗體與CPV標(biāo)準(zhǔn)抗原上的血凝素結(jié)合，當(dāng)CPV 標(biāo)準(zhǔn)抗原未完全被中和時，則剩余CPV與Au-McAb結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而與T線上的McAb結(jié) 合顯色；當(dāng)樣本中抗體完全中和了CPV標(biāo)準(zhǔn)抗原，則無剩余CPV可與Au-McAb形成復(fù)合物，T線 不顯色。
[0018] -種利用膠體金免疫層析技術(shù)，建立的簡便、快速測定CPV抗體HI效價的方法。其 特征在于將犬血清倍比稀釋后，分別與16個抗原單位的CPV標(biāo)準(zhǔn)抗原1:1等體積混合，在37 ±2°C反應(yīng)一段時間后，滴入上述CPV治療性單克隆抗體制備的膠體金試紙條，WT線消失的 最大血清稀釋度乘W 4為犬血清CPV抗體HI效價。
[0019] 本發(fā)明中試紙條檢測線（T線）消失時的血清最高稀釋倍數(shù)為試紙條檢測效價即 CGIA效價。
[0020] 本發(fā)明中所用單抗為根據(jù)國標(biāo)方法篩選的特異性針對血凝素的單抗，本發(fā)明發(fā)明 人通過大量的實驗驗證W及深入的綜合分析得出在本發(fā)明試紙條的各個相應(yīng)的生物墊上 包被特定的生物試劑可特異性結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)抗原(CPV病毒)上的血凝素從而捕獲抗原，犬血清 與標(biāo)準(zhǔn)抗原反應(yīng)后，本試紙條通過是否檢測到游離血凝素從而間接反應(yīng)出犬血清抗體的HI 效價。并在本發(fā)明試紙條的各個相應(yīng)的生物墊上包被特定比例范圍的生物試劑可使相應(yīng)的 效果更加明顯。
[0021] 本發(fā)明提供了運(yùn)用試紙條檢測犬血清中CPV抗體HI效價的方法，可替代血凝血抑 的方法，大大簡便了實驗操作并縮短了操作時間，降低了對操作者的要求，擴(kuò)大了使用范 圍。
[0022] 本發(fā)明試紙條用于犬血清抗體HI效價的定性檢測時，只需將犬血清直接稀釋至1: 20(使用16個抗原單位的標(biāo)準(zhǔn)抗原)檢測即可，若試紙條檢測血清CGIA效價Μ : 20,即HI效 價Μ : 80，則說明免疫合格;若CGIA< 1: 20，即HI效價< 1:80，則說明免疫不合格。同理，使用 其他抗原單位的標(biāo)準(zhǔn)抗原檢測時，只需將犬血清分別稀釋至1:10(32個抗原單位檢測）、1: 40 (8個抗原單位檢測）1:80 (4個抗原單位檢測）。 雜交瘤細(xì)胞保藏信息： 雜交瘤細(xì)胞株名稱:CPV 1D3 菌株分類:小鼠雜交瘤細(xì)胞系 保藏編號為:CGMCC No.4304 保藏日期:2010年11月03日 保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、(簡稱CGMCC) 保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
【附圖說明】
[0023] 圖1為試紙條內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖；
[0024] 圖2為試紙條外部結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】：
[0025] 提供下述實施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實施方 式，不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其 他現(xiàn)有技術(shù)的特征進(jìn)行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的方法和產(chǎn)品，均落在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0026] 本發(fā)明實驗材料的來源：
[0027] 生物材料：
[00%] CPV治療性單克隆抗體、CPV標(biāo)準(zhǔn)抗原化A