光子重組的非線性超分辨顯微方法及裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于共聚焦顯微領(lǐng)域，特別涉及一種光子重組的非線性超分辨顯微方法及 裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] -直以來，傳統(tǒng)的遠(yuǎn)場焚光顯微技術(shù)由于衍射極限的存在，因此在納米技術(shù)、材 料、生物以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等的應(yīng)用受到很大的限制。為了解決這一問題，自從上個世紀(jì)90年代 開始，人們提出了很多超分辨顯微方法。在這些所提出的方法中，熒光差分顯微技術(shù)(FED) 成為新近提出的方法中可以在不使用熒光標(biāo)記的情況下分析生物樣品。熒光差分顯微術(shù)基 于的是共聚焦顯微成像技術(shù)，它是利用兩個通過特定激發(fā)的光斑掃描得到的兩張圖像之差 來獲得分辨率的提高的。即待分析的樣品是分別被一個實心光斑接著被一個空心光斑照 明，將兩者以不同的比重進(jìn)行相減運(yùn)算即可重構(gòu)出超分辨圖像。實驗結(jié)果顯示，熒光差分顯 微在遠(yuǎn)場可以獲取小于四分之波長的分辨率并且具有較高的信噪比。
[0003] 然而，這種熒光差分顯微術(shù)存在圖像變形以及信息丟失的問題。在之前的系統(tǒng)中， 空心光斑是通過采用一個〇到2π的渦旋位相板調(diào)制一個與之同向的圓偏光實現(xiàn)的。由于空 心照明光斑的輪廓比實心光斑的要大得多，兩者相減后將導(dǎo)致獲得的有效點擴(kuò)散函數(shù)出現(xiàn) 負(fù)值旁瓣，而某些正值的強(qiáng)度可以通過負(fù)值強(qiáng)度來補(bǔ)償，因此在圖像重構(gòu)的過程中，去除的 負(fù)值強(qiáng)度將導(dǎo)致信息的丟失。這個問題的關(guān)鍵解決方法便是找到某種方法使產(chǎn)生的實心和 空心光斑具有大致相等的尺寸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種光子重組的非線性超分辨顯微方法和裝置，相對于其他超分辨 成像顯微鏡，該裝置是基于共聚焦顯微鏡，其結(jié)構(gòu)簡單，成像速度快，為生命科學(xué)和納米技 術(shù)提供了良好的研究手段。
[0005] 本發(fā)明通過光子重組以消除圖像變形而實現(xiàn)超分辨成像的方法，這種方法被稱為 飽和光照明虛擬熒光差分超分辨顯微術(shù)(svFED)。本顯微術(shù)通過高功率激光照明以達(dá)到熒 光的非線性效應(yīng)，采用針孔探測器陣列取代傳統(tǒng)共焦顯微成像中放置于像面上的單個針孔 探測器，利用光子重組技術(shù)，結(jié)合類似于熒光差分顯微術(shù)(FED)的方法，僅僅掃描所獲取的 空心光斑而無需獲取實心光斑，從而大大簡化了實驗裝置并進(jìn)一步提高了成像速度；同時 由于不存在負(fù)值旁瓣，使系統(tǒng)消除了成像變形這一困擾。仿真結(jié)果顯示光子重組的非線性 超分辨率顯微術(shù)相對于傳統(tǒng)共聚焦顯微術(shù)可提高至少39%。
[0006] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供了一種光子重組的非線性超分辨顯微方法，針對熒光樣品包括以下步 驟：
[0008] (1)激光器發(fā)出高功率照明光束，經(jīng)第一透鏡準(zhǔn)直和擴(kuò)束后得到準(zhǔn)直擴(kuò)束光束;所 述準(zhǔn)直擴(kuò)束后的照明光束經(jīng)第一偏振片后，得到線偏振光；
[0009] (2)所述線偏振光經(jīng)第一反射鏡反射后進(jìn)入0~231渦旋位相板調(diào)制入射光的相位； 所述被調(diào)制位相后的線偏光經(jīng)第一四分之一波片后補(bǔ)償了后面的二色鏡和第二反射鏡造 成的位相差，使其在經(jīng)第二反射鏡反射后的出射光為準(zhǔn)確的線偏光;所述位相差得到補(bǔ)償 的偏振光經(jīng)半波片后得到改變了線偏振方向的出射光;所述出射光經(jīng)二色鏡反射后進(jìn)入第 二反射鏡;所述經(jīng)第二反射鏡反射的反射光再經(jīng)過第二四分之一波片后變成位相受到調(diào)制 的圓偏振光;所述位相受到調(diào)制的圓偏光經(jīng)過物鏡后聚焦到位于所述物鏡焦面處樣品平面 上形成空心光斑照明熒光樣品；
[0010] (3)所述熒光樣品被高功率的空心光斑照明后，在非線性的作用下，產(chǎn)生飽和效 應(yīng)，激發(fā)出飽和熒光;所述達(dá)到飽和效應(yīng)的熒光被所述物鏡收集，經(jīng)所述第二四分之一波片 后由所述第二反射鏡反射后進(jìn)入所述二色鏡;所述熒光經(jīng)所述二色鏡透射后進(jìn)入濾光片濾 光后進(jìn)入第二透鏡;所述經(jīng)濾光片濾光后的熒光由第二透鏡會聚到由多個光電探測器組成 的探測器陣列上參與成像；
[0011] (4)所述探測器陣列將光信號轉(zhuǎn)換為電信號并傳送給計算機(jī);所述計算機(jī)將每個 探測器探測到的空心光斑做相應(yīng)的平移后疊加，得到實心光斑的圖像，完成了對樣品一個 點的信息讀入和處理；
[0012] (5)所述熒光樣品放置于納米移動平臺上;所述樣品平臺與所述計算機(jī)相連，通過 所述計算機(jī)的控制軟件實現(xiàn)納米移動平臺的在二維平面的移動完成對所述熒光樣品的二 維掃描。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種光子重組的非線性超分辨顯微裝置，針對熒光樣品包括：
[0014] (1)高功率激光器，用于發(fā)出短波長高功率激光，實現(xiàn)對熒光樣品的照明，利用熒 光的非線性效應(yīng)，以使其達(dá)到飽和從而激發(fā)飽和熒光；
[0015] (2)第一透鏡，用于對激光器發(fā)出的激光進(jìn)行準(zhǔn)直和擴(kuò)束；
[0016] (3)偏振片，用于使準(zhǔn)直并擴(kuò)束后的激光變成線偏振光；
[0017] (4)第一反射鏡、第二反射鏡，用于反射光路，使光路變得緊湊；
[0018] (5)0~2π渦旋位相板，用于調(diào)制入射光的相位，從而使所述激光在樣品面聚焦時 形成空心光斑；
[0019] (6)第一四分之一波片，用于補(bǔ)償入射光經(jīng)后面的二色鏡和第二反射鏡后帶來的 位相差，使其在經(jīng)第二反射鏡反射后為準(zhǔn)確的線偏光；
[0020] (7)二分之一波片，用于調(diào)整入射光的線偏振方向；
[0021] (8)二色鏡，用于使激光反射同時使被激發(fā)的熒光透射；
[0022] (9)第二四分之一波片，用于使相位受到調(diào)制的入射光變成圓偏振光；
[0023] (10)物鏡，用于將相位受到0~2π調(diào)制的圓偏振光會聚到樣品面上，收集熒光樣品 被激發(fā)后所發(fā)出的熒光；
[0024] (11)濾光片，用于濾除經(jīng)所述樣品面反射回來的激光，而僅使熒光樣品發(fā)出的熒 光通過參與成像；
[0025] (12)第二透鏡，用于將所述熒光樣品發(fā)出的熒光會聚到所述探測器陣列上；
[0026] (13)探測器陣列，由15x15個帶有針孔的光電探測器所組成的陣列，如圖3所示的 矩形陣列，用于將探測到的光信號轉(zhuǎn)換為電信號并傳送至計算機(jī)；
[0027] (14)納米平移臺，通過控制納米位移平臺完成對樣品的二維平面掃描；
[0028] (15)計算機(jī)，用于處理探測器傳送過來的信號，同時控制納米移動平臺的平動使 其完成對樣品的二維平面掃描。
[0029] 本發(fā)明的原理如下：
[0030] 本發(fā)明在傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡裝置(如圖1所示）的基礎(chǔ)上，首先經(jīng)準(zhǔn)直擴(kuò)束后的高 功率激光光束入射到一偏振片后變成線偏光，線偏光再經(jīng)過0~231渦旋位相板調(diào)制后經(jīng)過 物鏡前的四分之一波片后形成位相受到調(diào)制的圓偏振光，再由物鏡聚焦到位于其焦面上的 樣品平面后形成高強(qiáng)度空心光斑，激發(fā)光照明熒光樣品后使其激發(fā)產(chǎn)生熒光。當(dāng)激發(fā)光強(qiáng) 度較小時，所激發(fā)的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)成正比，當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)I超過某一臨界值Is后，如果 持續(xù)增加光強(qiáng)，熒光將產(chǎn)生非線性效應(yīng)，即熒光的發(fā)射強(qiáng)度將保持恒定，產(chǎn)生熒光飽和現(xiàn) 象。這是由于較強(qiáng)的激發(fā)光造成熒光分子的吸收截面減小，從而降低了分子實際捕獲激發(fā) 光光子的能力，BP
[0031] 〇'cs = ocs(l+I/Is)
[0032]其中，〇'。3為熒光分子的實際吸收截面，ocs = 23t(A/2jt)2( yr/ Γ tC)t)為熒光分子的 吸收截面，Γ tclt，γ 4Ρλ分別為吸收總頻率寬、自發(fā)輻射熒光率和激發(fā)光波長。此時的點擴(kuò) 散函數(shù)將產(chǎn)生變形，其峰值將被削平，如圖5所示。這種變形后的點擴(kuò)散函數(shù)在空間頻域內(nèi) 包含更多的高頻分量，從而可以探測物體更多的高頻信息。物鏡將收集到的飽和熒光經(jīng)成 像光路后，最終成像在探測器陣列上，則探測器陣列上所記錄的光強(qiáng)為：
[0033]
[0034] 其中，？代表樣品上被掃描的位置矢量，？'代表物空間上的物的位置矢量，J代表 探測器所在的位置矢量，〇表示熒光樣品發(fā)出的光強(qiáng);有效點擴(kuò)散函數(shù)為：
[0035]
[0036] 式中：ΜΚ?')代表激發(fā)點擴(kuò)散函數(shù)，分')代表探測點擴(kuò)散函數(shù)，共輒焦點處 的針孔探測器單元所對應(yīng)的有效點擴(kuò)散函數(shù)如圖6所示。
[0037] 當(dāng)探測器單元不是處在共輒焦點上時，該探測器單元所探測到的探測點擴(kuò)散函數(shù) 將發(fā)生平移，從而使有效點擴(kuò)散函數(shù)的峰值產(chǎn)生平移，如圖7(a)中的點虛線和線虛線所示 分別表示距離共輒點探測器±〇.25λ處所對應(yīng)的有效點擴(kuò)散函數(shù)。故假如直接將每個探測 器單元所獲得的有效點擴(kuò)散函數(shù)加起來，則所獲得的有效點擴(kuò)散函數(shù)將產(chǎn)生較大的輪廓， 從而與未采用針孔探測器的共焦顯微一樣降低了分辨率。所以，在已知探測器陣列中每個 探測單元的實際位置時，將每個探測器單元所對應(yīng)的有效點擴(kuò)散函數(shù)作一定的平移，如圖7 (b)點虛線和線虛線所示，然后再相加，這一過程被稱為光子重組，用公式表示即：
[0038]
[0039] 其中q稱為平移因子，采用卷積的形式寫出該光強(qiáng)即為：
[0040]
[0041]
[0042]
[0043] 由于探測器陣列中的每個探測單元所獲得的有效點擴(kuò)散函數(shù)的空心暗斑位置都 與共輒焦點處探測器單元所得到的暗斑位置重合，當(dāng)對探測器陣列中的每個探測單元所對 應(yīng)的有效點擴(kuò)散函數(shù)作光子重組后，中心暗斑位置處將被光子填充，從而使作光子重組后 的有效點擴(kuò)散函數(shù)變成一個中心較周圍強(qiáng)度稍低的實心光斑，其有效點擴(kuò)散函數(shù)如圖8所 不。
[0044]那么利用與熒光差分(FED)-樣的原理，將光子重組所獲得的實心光斑對應(yīng)的有 效點擴(kuò)散函數(shù)減去一定比例的處于熒光樣品共輒點處探測單元所得到的空心光斑對應(yīng)的 有效點擴(kuò)散函數(shù)即可獲得一個光斑更小的實心光斑，所對應(yīng)的有效點擴(kuò)散函數(shù)如圖9所示。 對于處于共輒點的探測單元所得到空心光斑的光強(qiáng)分布為：
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]則重構(gòu)圖像后的光強(qiáng)為：
[0049]
[0050] 其中，p為減數(shù)因子。采用卷積形式可以寫成：
[0051]
[0052]
[0053]
[0054]適當(dāng)選擇平移因子q和減數(shù)因子p可以獲得一個半高全寬很小的重構(gòu)點擴(kuò)散函數(shù)。 如此便完成了對單個物點的圖像讀入和處