定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)計一種微塑料健康風險評價方法，更具體來說就是一種基于熒光標記技術(shù)定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布規(guī)律的方法，即一種基于現(xiàn)代熒光技術(shù)分析微塑料這種新興污染物在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的新型檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，塑料這種材料在當今生活中的重要作用。各種塑料制品在給人們生活帶來各種便利的同時，也帶來了各種潛在健康風險，其中最突出就是塑料制品在被丟棄后經(jīng)過一定的物理、化學、生物等作用，會變成顆粒越來越小的塑料顆粒一一微塑料。但是這種塑料顆粒不會被自然環(huán)境降解，而是一直存留在環(huán)境中，甚至會進入生物體內(nèi)，帶來環(huán)境健康風險。在評價微塑料的健康風險過程中，急需準確、靈敏、方便快捷的方法來檢測微塑料在生物體內(nèi)的富集和分布規(guī)律，這是準確評估微塑料健康危害的基本前提。
[0003]目前的研究多集中在證明微塑料是否能進入生物體內(nèi)，其方法可總結(jié)為:水生動物進行一定量的微塑料暴露，然后采用高倍顯微鏡或者偏振光檢測儀器檢測生物體內(nèi)是否具有微塑料。然而，這些研究主要針對水生生物，對哺乳動物體內(nèi)微塑料含量缺乏有效的檢測方法，且這些方法通常只能定性分析，不能進行準確的定量，也無法得到微塑料在不同組織器官的富集和分布規(guī)律。
[0004]因此，急需一種簡單、靈敏、準確定量分析微塑料在哺乳動物生物體內(nèi)富集和分布規(guī)律的方法。本發(fā)明整合材料合成技術(shù)和熒光檢測技術(shù)，可以有效的采用熒光微塑料對模式動物進行暴露實驗，準確進行生物體內(nèi)微塑料含量的檢測，為微塑料健康風險評價奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)在普遍缺乏對哺乳動物體內(nèi)微塑料含量準確定量的方法，本發(fā)明提供一種基于熒光技術(shù)分析體內(nèi)微塑料含量的方法，即基于熒光微塑料的制備和熒光檢測方法結(jié)合的生物學檢測方法，通過本發(fā)明可以對不同粒徑的微塑料在生物體內(nèi)分布及其富集規(guī)律進行準確的定量分析，為后續(xù)的微塑料毒性評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
[0006]具體來說，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
一種定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
(1)熒光微塑料顆粒的制備:首先配制10_20mL的三氯甲烷與異丙醇1:1體積比的混合溶劑，然后稱取0.1-0.2g交聯(lián)聚苯乙烯微球和5-10mg的4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑加入上述混合溶劑中，并在超聲和氮氣保護條件下分散溶解，充分溶解后的混合液體進行干燥，然后用于50-70%乙醇洗滌以去除多余熒光染料，接著離心回收熒光微塑料，制備出帶綠色熒光的PS微球；
(2)哺乳動物暴露實驗:選擇上述合成的熒光標記微塑料作為受試樣品，選取模式哺乳動物進行灌胃染毒實驗，以健康哺乳動物作為空白對照組；
(3)樣品采集:熒光微塑料染毒周期結(jié)束以后，受試動物解剖，采集組織樣品；
(4)冷凍干燥組織樣品:使用冷凍干燥儀，分別冷凍干燥空白組和染毒組的組織樣品至恒重；
(5)濕法消解樣品:稱取一定量的凍干組織樣品，采用濕法消解組織樣品；
(6)熒光定量檢測微塑料含量:采用空白組動物的組織消解液，加入已知含量的熒光微塑料，制備不同濃度梯度的懸濁液，在設(shè)定的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長下，用熒光光譜儀檢測其熒光值，以熒光強度和對應的微塑料濃度繪制出標準曲線，然后檢測暴露組組織消解液的熒光值，根據(jù)標準曲線確定組織液微塑料濃度，并換算出各組織中微塑料含量。
[0007]其中，在步驟(I)中，超聲分散條件為在100W超聲下處理15-20分鐘，干燥條件為真空干燥箱中在0.151^&、32°035°(:下干燥12-16小時，以50-70%乙醇洗滌并隨后在6000印111/min下離心10-20分鐘，洗滌和離心重復3-5次，以回收制備出的綠色熒光PS微球。
[0008]在步驟(2)中，模式哺乳動物為大鼠或小鼠，染毒實驗的染毒周期為一周。
[0009]另外，在步驟(3)中，所采集的組織樣品為肝臟、腎臟、小腸或其組合。
[0010]進一步，在步驟(4)中，凍干條件為在-10大氣壓和_50°C條件下冷凍干燥組織樣品至恒重。
[0011 ]其中，在步驟(5)中，稱取一定量的凍干組織樣品，采用濕法消解組織樣品，具體消解條件為每0.1克組織樣品中加入I毫升的65%V/V硝酸，70°C水浴2小時，然后加入與硝酸等體積的30%V/V雙氧水，850C水浴2小時，消解結(jié)束后，消解液呈現(xiàn)淡黃透明，定容到10毫升。
[0012]在步驟(6)中，設(shè)定的最大激發(fā)波長為445nm，最大發(fā)射波長為550nmo
[0013]有益效果
本發(fā)明基于熒光微塑料合成技術(shù)和熒光微塑料檢測技術(shù)，提供一種基于熒光標記技術(shù)定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布規(guī)律的方法，填補了當今尚無便捷、準確定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布檢測方法的空缺，為后續(xù)微塑料的環(huán)境健康風險甚至是人體健康風險評價提供準確的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明方法的流程圖；
圖2為本發(fā)明的熒光微塑料在熒光顯微鏡以及掃描電鏡下的照片；
圖3至圖8為本發(fā)明的熒光定量檢測的標準曲線；
圖9為本發(fā)明的暴露組哺乳動物各組織器官中微塑料的含量。
【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明是一種基于熒光標記技術(shù)定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布規(guī)律的方法，其具體步驟如下:
(I)熒光微塑料制備:首先，配置三氯甲烷和異丙醇的混合溶劑10-20mL(l:l)，然后稱取0.1-0.2g的交聯(lián)聚苯乙烯(PS)微球和5-10mg的熒光染料4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑(NBD-CL)加入上述混合溶劑中，并在超聲(15-20min，100W)和氮氣保護條件下分散溶解。充分溶解后的混合液體置于真空干燥箱中(32 oC-35oC,0.15Mpa)干燥12_16h，待溶液干燥后，用50%-70%乙醇洗滌聚苯乙烯微球去除多余熒光染料，接著使用離心機(10-20min，6000rpm/min)離心出熒光微塑料(洗滌和離心過程重復3-5次)。此方法可以制備出帶綠色熒光PS微球。
[0016](2)哺乳動物暴露實驗:以制備的已知粒徑的熒光微塑料為受試樣品，選取模式動物(如小鼠、大鼠等模式哺乳動物)進行灌胃暴露實驗(空白組模式動物不進行暴露實驗)，每個實驗組10只模式動物，染毒時間一周，以健康哺乳動物作為空白對照組；
(3)樣品采集:暴露周期結(jié)束后，解剖模式動物，采集肝臟、腎臟和小腸等組織器官，并記錄相應的質(zhì)量，然后轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱；
(4)冷凍干燥組織樣品:從超低溫冰箱中轉(zhuǎn)移出組織至冷凍干燥儀(LABCON⑶，USA)，在-10大氣壓和-50°C條件下冷凍干燥組織樣品至恒重；
(5)濕法消解組織樣品:分別稱取經(jīng)冷凍干燥的動物組織樣品0.1克，加入I毫升硝酸(65%，V/V)，70°C水浴2小時，加入I毫升的雙氧水(30%，V/V)，85°C水浴2小時，消解結(jié)束后消解液呈現(xiàn)淡黃透明狀態(tài)，定容到1毫升。
[0017](6