一種檢測海洋多糖生物活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)品生物活性檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測海洋多糖生物活 性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界中的植物、動物及微生物體內(nèi)都含有多糖。多糖在醫(yī)藥及食品保健領(lǐng)域迅 速發(fā)展，具有很好的開發(fā)前景。海洋生物由于特殊的生活環(huán)境，導(dǎo)致海洋生物體內(nèi)多糖的合 成過程與陸地生物不同，并產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎，作用特殊的活性物質(zhì)，其中不少海洋生物特 有顯著的抗腫瘤功能和免疫調(diào)節(jié)作用，具有很高的研究價值。
[0003] 海洋生物多糖根據(jù)來源不同可分為三大類，海藻多糖，海洋動物多糖和海洋微生 物多糖。不同多糖的生物活性有所差別，活性高低受多糖的結(jié)構(gòu)、分子量等多種因素影響， 多糖類藥品及保健品的功效存在很大差異，檢測海洋多糖的生物活性是判斷多糖藥品及保 健品功效的方法之一。傳統(tǒng)的動物學實驗檢測多糖活性方法存在動物個體差異、工作量大、 資金消耗多等問題。
[0004] 因此，建立一種新的檢測海洋多糖調(diào)節(jié)巨噬細胞內(nèi)N0生成的方法勢在必行。
[0005] 體外免疫調(diào)節(jié)活性的檢測通常采用的是Griess試劑盒法，在檢測過程中酶標儀發(fā) 揮著重要的作用。酶標儀檢測是根據(jù)細胞群體染色后的吸光值大小判斷細胞活性。其中 Griess試劑盒是檢測細胞分泌到上清液中的N0濃度的常用方法。細胞經(jīng)多糖樣品處理后， 分泌N0到上清液中，此時N0極易氧化生成N〇2-，在酸性條件下，N〇2-促使Griess反應(yīng)發(fā)生而 生成重氮化合物，使溶液顯色，從而在540nm處測定各孔的0D值。通過標準曲線的計算，將0D 值換算成N0濃度。該方法的不足是僅通過0D值來間接反映上清液中N0的量，而不能像本方 法一樣直接檢測上清液中N0 ·自由基的量從而反映 N0濃度，準確度和創(chuàng)新性較差。
[0006] 有關(guān)電子自旋共振波譜技術(shù)迄今還未見涉及體外(細胞體系)檢測相關(guān)專利，亦未 見利用電子自旋共振波譜技術(shù)檢測N0的相關(guān)專利，故利用電子自旋共振波譜技術(shù)對于海洋 多糖活性更深入的研究將具有突破性的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測海洋多糖生物活性的方法，以解決利用動物學實驗 檢測多糖活性方法存在動物個體差異、工作量大、資金消耗多的技術(shù)問題。
[0008] -種檢測海洋多糖生物活性的方法，包括以下步驟：
[0009] 步驟1，將海洋多糖樣品配制成一定濃度的多糖溶液;優(yōu)選地，在步驟1中，利用達 爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基配制多糖溶液。DMEM(dulbecco's modified eagle medium達爾 伯克改良伊格爾培養(yǎng)基）
[0010] 步驟2,將巨細胞調(diào)整至一定的細胞密度;優(yōu)選地，在步驟2中，所述巨·細胞為 RAW264.7巨噬細胞。更優(yōu)選地，在步驟2中，RAW264.7巨噬細胞的濃度為105~106個/ml。優(yōu)選 地，在步驟2中，利用達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度。
[0011] 步驟3，利用步驟1的多糖溶液和步驟2得到的細胞液配置一系列混合液，混合液的 巨噬細胞的細胞密度相同，海洋多糖的濃度不同；然后進行巨噬細胞細胞培養(yǎng);優(yōu)選地，在 步驟3中，混合液中海洋多糖的濃度在0~200μg/ml之間。優(yōu)選地，步驟3中，進行巨噬細胞培 養(yǎng)的條件為:置于37 °C、C〇2體積濃度為5 %的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。
[0012] 步驟4，取步驟3得到的培養(yǎng)物收集細胞上清液；
[0013] 步驟5,取步驟4得到的細胞上清液用電子自旋共振波譜法檢測氮氧自由基N0 ·的 濃度，檢測值的高低說明被檢測多糖樣品的體外免疫調(diào)節(jié)活性高低。
[0014] 優(yōu)選地，步驟5中檢測氮氧自由基N0 ·的濃度的過程如下：
[0015] 1)向細胞上清液中加入N0 ·自由基捕獲劑；
[0016] 2)用石英毛細管吸取1)中混合液至適當高度，用凡士林封毛細管下口；
[0017] 3)電子自旋共振波譜儀檢測N0 ·自由基生成情況，得到檢測值；電子自旋共振波 譜儀檢測具體參數(shù)如下:X-波段;調(diào)制頻率100kHz;諧振頻率9.4GHz;微波功率25mW;調(diào)制幅 度0.25mT;中心磁場356mT;掃描時間30s;掃描寬度10mT;時間常數(shù)0.1 s;溫度26°C。優(yōu)選地， 所述自由基捕獲劑為含有l(wèi)Ommol · 1/?⑶和2mmol · I^FeSOa的溶液。Μ⑶是DETC的衍生物， 全稱為:methyl-D_glucamine dithiocarbamate，甲基葡萄糖胺二硫代氨基甲酸鹽。
[0018] 本發(fā)明采用穩(wěn)定的單核巨噬細胞株RAW264.7細胞，通過細胞上清液中N0 ·自由基 含量來評價海洋多糖免疫調(diào)節(jié)活性，降低了檢測難度，提高了檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，豐富了檢 測方法，有望應(yīng)用于細胞生物學，藥物分析，環(huán)境毒性物質(zhì)檢測等相關(guān)領(lǐng)域。
[0019] 本發(fā)明采用的檢測方法為電子自旋共振波譜檢測技術(shù)，其具有檢測范圍廣、檢測 對象廣泛、檢測條件簡單、檢測靈敏度高等優(yōu)點。當經(jīng)藥物刺激后的細胞上清液中N0濃度很 低時，利用普通的方法可能不能檢出，但利用本方法將大大提高靈敏度。
[0020] 本發(fā)明實現(xiàn)了快速有效檢測海洋多糖免疫調(diào)節(jié)活性，檢測過程簡潔，檢測結(jié)果穩(wěn) 定可靠，并且本發(fā)明從自由基的角度為該方面的檢測拓寬了思路。
【附圖說明】
[0021] 圖1為實施例1的得到(MGD)2-Fe2+-NO信號圖譜；
[0022]圖2為實施例2的得至lj(MGD)2-Fe2+-NO信號圖譜；
[0023]圖3為實施例3的得至lj(MGD)2-Fe2+-NO信號圖譜；
[0024] 圖4為不同濃度(MGD)2Fe2+-NO所對應(yīng)的ESR譜。
【具體實施方式】
[0025]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，實施例中未注明具體條件 者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以 通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0026] 本發(fā)明所述檢測海洋多糖生物活性的方法的實施方式包括以下步驟：
[0027] 步驟1，將海洋多糖樣品配制成一定濃度的多糖溶液;在步驟1中，利用達爾伯克改 良伊格爾培養(yǎng)基配制多糖溶液。DMEM(dulbecco's modified eagle medium達爾伯克改良 伊格爾培養(yǎng)基）
[0028] 步驟2,將巨噬細胞調(diào)整至一定的細胞密度;在步驟2中，所述巨噬細胞為RAW264.7 巨噬細胞。在步驟2中，RAW264.7巨噬細胞的濃度為105~106個/ml。在步驟2中，利用達爾伯 克改良伊格爾培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度。
[0029] 步驟3，利用步驟1的多糖溶液和步驟2得到的細胞液配置一系列混合液，混合液的 巨噬細胞的細胞密度相同，海洋多糖的濃度不同；然后進行巨噬細胞細胞培養(yǎng);在步驟3中， 混合液中海洋多糖的濃度在0~200μg/ml之間。步驟3中，進行巨噬細胞培養(yǎng)的條件為:置于 37 °C、C02體積濃度為5 %的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。
[0030] 步驟4,取步驟3得到的培養(yǎng)物收集細胞上清液；
[0031] 步驟5,取步驟4得到的細胞上清液用電子自旋共振波譜法檢測氮氧自由基NO ·的 濃度，檢測值的高低說明被檢測多糖樣品的體外免疫調(diào)節(jié)活性高低。
[0032]步驟5中檢測氮氧自由基NO ·的濃度的過程如下：
[0033] 1)向細胞上清液中加入N0 ·自由基捕獲劑；
[0034] 2)用石英毛細管吸取1)中混合液至適當高度，用凡士林封毛細管下口；
[0035] 3)電子自旋共振波譜儀檢測N0 ·自由基生成情況，得到檢測值；電子自旋共振波 譜儀檢測具體參數(shù)如下:X-波段;調(diào)制頻率100kHz;諧振頻率9.4GHz;微波功率25mW;調(diào)制幅 度0.25mT;中心磁場356mT;掃描時間30s;掃描寬度10mT;時間常數(shù)0.1 s;溫度26°C。優(yōu)選地， 所述自由基捕獲劑為含有l(wèi)Ommol · L-^⑶和2mmol · L-^eSO*的溶液。
[0036] 以下實施例中所用試劑和儀器的生產(chǎn)廠家及型號如下：
[0037] 儀器:0)2培養(yǎng)箱，日本5六階0,5六(：〇^)/5六(：;電子自旋共振波譜儀化51〇，德國布魯 克，A200。
[0038]試劑：DMEM培養(yǎng)基，HIGH GLUCOSE(IX)，HyClone;MGD，人工制備（NaOH 10g溶于 100mL水，加冰25g，N-甲基-D-葡糖胺48.8g，溶解后放入冰浴中，滴加二硫化碳甲醇溶液 (25mL二硫化碳，75mL甲醇），析出Μ⑶結(jié)晶）；NaOH，分析純，天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠； N-甲基-D-葡糖胺，99%，葉源生物;二硫化碳，上海倍卓生物科技有限公司；甲醇，分析純， 北京化工廠;FeS04，分析純，天津大茂化學試劑廠;凡士林，天津大茂化學試劑廠。
[0039]實施例1扇貝多糖調(diào)節(jié)巨噬細胞內(nèi)N0生成的檢測
[0040]取扇貝多糖樣品，用DMEM培養(yǎng)基或蒸餾水配制200yg/mL的扇貝多糖溶液；
[0041 ] 用DMEM培養(yǎng)基將RAW264.7細胞密度調(diào)整至105~106個/mL;
[0042] 將調(diào)整好密度的細胞置于96孔細胞培養(yǎng)板中，在37°C下培養(yǎng)24h;
[0043] 96孔培養(yǎng)板中加入適量扇貝多糖，使扇貝多糖濃度分別為0yg/mL、12.5yg/mL、25y g/mL、50yg/mL、100yg/mL、200yg/mL;
[0044] 37°C、C02濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h;
[0045] 收集細胞上清；
[0046]用ESR法檢測N0 ·自由基濃度；
[0047] 向tube管中加細胞上清及N0 ·自由基捕獲劑(