一種將紫杉醇類物質(zhì)固定在固相載體上的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種將紫杉醇類物質(zhì)固定在固相載體 上的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫杉醇（taxol)是一種四環(huán)二萜化合物，是細(xì)胞有絲分裂抑制劑，被用于癌癥治 療。紫杉醇屬有絲分裂中的微管抑制劑，紫杉醇具有聚合和穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)微管的作用，致使快 速分裂的腫瘤細(xì)胞在有絲分裂階段被牢牢固定，使微管不再分開，可阻斷細(xì)胞于細(xì)胞周期 的G2與M期，使癌細(xì)胞復(fù)制受阻斷而死亡。在癌癥治療中，患者組織中紫杉醇的含量對(duì)治 療效果很關(guān)鍵，通常需要維持較低的水平。因?yàn)閷?duì)細(xì)胞而言，紫杉醇濃度過大會(huì)導(dǎo)致正常細(xì) 胞大量死亡。因此，經(jīng)常監(jiān)測(cè)患者組織中紫杉醇的含量及代謝需要一種快速、靈敏的檢測(cè)方 法。
[0003] 目前，紫杉醇的檢測(cè)方法有紫外檢測(cè)法、高效液相色譜法及競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶聯(lián)免 疫法（Competitive Inhibition Enzyme Immunoassay，CIEIA)等，紫外檢測(cè)法和高效 液相色譜法需要大量采集樣品，且檢測(cè)較慢、成本過高；CIEIA是利用酶聯(lián)免疫原理，通 過顯色反應(yīng)，不經(jīng)純化，快速檢測(cè)粗提混合物中紫杉醇的方法。Jaziri等用該方法可以 檢測(cè)到植物組織及愈傷組織中l(wèi) -l〇〇ng含量的紫杉醇（Jaziri等1991. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection and the semi-quantitative determination of taxane diterpenoids related to taxol in Taxus sp. and tissue cultures. J Pharm Belg. 1991Mar_Apr ;46(2) :93_9)。利用該方法，Grothaus 等可以檢測(cè)到血衆(zhòng)中 0? 3ng/ml 的紫杉酉享（Grothaus 等 1993. An enzyme immunoassay for the determination of taxol and taxanes in Taxus sp.tissues and human plasma. J Immunol Methods. 1993Jan 14 ； 158(1) :5-15.) 〇
[0004] 在現(xiàn)有的CIEIA檢測(cè)紫杉醇的方案中，如圖1所示，紫杉醇一般通過在吡啶溶液中 與琥珀酸酐反應(yīng)，生成2-紫杉醇琥珀酰單酯，然后加入牛血清白蛋白（BSA)溶液及25%二 氧六環(huán)水溶液（v/V)，使2-紫杉醇琥珀酰單酯與BSA的氨基通過酰胺鍵結(jié)合形成BSA偶聯(lián) 產(chǎn)物，通過BSA的吸附作用固定于微孔板1上，然后再通過CIEIA測(cè)定樣品中紫杉醇的含 量。由于將紫杉醇固定在微孔板上的該方法步驟多，效率低、時(shí)間長(zhǎng)，不能很好地滿足經(jīng)常 監(jiān)測(cè)患者組織中紫杉醇的含量的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出一種將紫杉醇類物質(zhì)固定在固相載體 上的方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)問題通過以下的技術(shù)方案予以解決：
[0007] -種將紫杉醇類物質(zhì)固定在固相載體上的方法，所述固相載體的表面結(jié)合有馬來 酸酐，所述方法為通過紫杉醇類物質(zhì)與所述馬來酸酐反應(yīng)，從而將所述紫杉醇類物質(zhì)固定 在所述固相載體上。
[0008] 優(yōu)選地，所述紫杉醇類物質(zhì)與所述馬來酸酐反應(yīng)包括如下步驟：
[0009] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇類物質(zhì)和吡啶，在每毫升所述吡啶中，所 述紫杉醇類物質(zhì)的含量為100-1000微克；
[0010] (2)將所述溶液加入所述固相載體，在反應(yīng)溫度為25-65°C下，所述紫杉醇類物質(zhì) 的2' -羥基與馬來酸酐反應(yīng)至少8小時(shí)，形成2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0011] 優(yōu)選地，所述紫杉醇類物質(zhì)與所述馬來酸酐反應(yīng)包括如下步驟：
[0012] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇類物質(zhì)和吡啶溶液，所述吡啶溶液包含吡 啶和能與所述吡啶互溶的溶劑，所述吡啶與溶劑的體積比大于等于1%且小于1〇〇%，在每 毫升所述吡啶溶液中，所述紫杉醇類物質(zhì)的含量為100-1000微克；
[0013] (2)將所述溶液加入所述固相載體，在反應(yīng)溫度為25-65°C下，所述紫杉醇類物質(zhì) 的2' -羥基與馬來酸酐反應(yīng)至少8小時(shí)，形成2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0014] 紫杉醇在吡啶中，其較活躍的2' -OH和固相載體表面的馬來酸酐反應(yīng)，而7' -OH 由于空間結(jié)構(gòu)的問題較不活躍，因此反應(yīng)生成2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0015] 優(yōu)選地，所述紫杉醇類物質(zhì)的含量為200-300微克。
[0016] 優(yōu)選地，步驟（2)中，反應(yīng)溫度為50-60 °C。
[0017] 優(yōu)選地，所述吡啶與溶劑的體積比為1-5 %。
[0018] 優(yōu)選地，步驟（2)中的反應(yīng)時(shí)間為30-40小時(shí)。
[0019] 優(yōu)選地，步驟（1)中的所述溶劑為水、PBS緩沖液、甲醇、礦物油、甲醛、二甲基亞砜 和正己烷中的至少一種。
[0020] 優(yōu)選地，所述紫杉醇類物質(zhì)具有如下結(jié)構(gòu)式：
[0021]
[0022]當(dāng)1?1=(：6115，1?2=01 30)時(shí)，為紫杉醇；當(dāng)1?1=(013)30)，1? 2=11時(shí)，為多烯紫杉醇。
[0023] -種用于檢測(cè)紫杉醇類物質(zhì)的中間體，包括固相載體和紫杉醇類物質(zhì)，所述固相 載體的表面結(jié)合有馬來酸酐，所述紫杉醇類物質(zhì)通過與所述馬來酸酐反應(yīng)從而結(jié)合在所述 固相載體上。
[0024] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的方法是利用經(jīng)馬來酸酐活化的固相載體直接結(jié)合紫杉醇 類物質(zhì)，從而可以直接進(jìn)入后續(xù)的CIEIA檢測(cè)步驟，該方法反應(yīng)步驟少，干擾雜質(zhì)少，反應(yīng) 專一性強(qiáng)，和現(xiàn)有方法相比具有在紫杉醇類物質(zhì)的檢測(cè)中更加方便、快捷、靈敏、實(shí)用等優(yōu) 點(diǎn)。
【附圖說明】
[0025] 圖1是現(xiàn)有技術(shù)中的紫杉醇通過BSA偶聯(lián)產(chǎn)物固定到微孔板表面上的反應(yīng)示意 圖；
[0026] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中的紫杉醇固定在孔板上的反應(yīng)示意圖；
[0027] 圖3是CIEIA檢測(cè)待測(cè)樣品中紫杉醇的含量的原理示意圖；
[0028] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例2中在450nm下測(cè)定得到的光吸收曲線；
[0029] 圖5是根據(jù)圖4中的成線性的0. 05-5ng/mL濃度區(qū)間下制得的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)物在 0. 05_5ng/mL區(qū)間的工作曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面對(duì)照附圖并結(jié)合優(yōu)選的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0031] 本發(fā)明提供一種將紫杉醇類物質(zhì)固定在固相載體上的方法，在一種【具體實(shí)施方式】 中，所述固相載體的表面結(jié)合有馬來酸酐，所述方法為通過紫杉醇類物質(zhì)與所述馬來酸酐 反應(yīng)，從而將所述紫杉醇類物質(zhì)固定在所述固相載體上。
[0032] 較優(yōu)地，所述方法為通過通過紫杉醇類物質(zhì)的2' _羥基與所述馬來酸酐反應(yīng)形成 2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0033] 在一些較優(yōu)的實(shí)施方式中，所述紫杉醇類物質(zhì)與所述馬來酸酐反應(yīng)包括如下步 驟：
[0034] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇類物質(zhì)和吡啶，在每毫升所述吡啶中，所 述紫杉醇類物質(zhì)的含量為100-1000微克；
[0035] (2)將所述溶液加入所述固相載體，在反應(yīng)溫度為25_65°C下，所述紫杉醇類物質(zhì) 的2' -羥基與馬來酸酐反應(yīng)至少8小時(shí)，形成2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0036] 在另一些較優(yōu)的實(shí)施方式中，所述紫杉醇類物質(zhì)與所述馬來酸酐反應(yīng)包括如下步 驟：
[0037] (1)配制溶液，所述溶液中含所述紫杉醇類物質(zhì)和吡啶溶液，所述吡啶溶液包含吡 啶和能與所述吡啶互溶的溶劑，所述吡啶與溶劑的體積比大于等于1%且小于100%，在每 毫升所述吡啶溶液中，所述紫杉醇類物質(zhì)的含量為100-1000微克；
[0038] (2)將所述溶液加入所述固相載體，在反應(yīng)溫度為25-65°C下，所述紫杉醇類物質(zhì) 的2' -羥基與馬來酸酐反應(yīng)至少8小時(shí)，形成2' -馬來酸紫杉醇類酯。
[0039] 由于過高濃度的吡啶對(duì)有機(jī)塑料基質(zhì)的固相載體材料有一定的腐蝕作用，從而影 響下面的反應(yīng)，因此在加入固相載體前，再加入另一可以與吡啶互溶的溶劑以減小吡啶的 濃度，通過實(shí)驗(yàn)，吡啶與溶劑的體積比為1-5%時(shí)，既能使反應(yīng)結(jié)果很好，又能防止吡啶對(duì)固 相載體的腐蝕。
[0040] 在以上優(yōu)選實(shí)施方式中，紫杉醇類物質(zhì)與馬來酸酐的反應(yīng)還受到反應(yīng)溫度的影 響，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了在25°C、37°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C等溫度下的反應(yīng)結(jié)合效果，發(fā)現(xiàn) 在反應(yīng)溫度為50-60°C時(shí)，效果較優(yōu)。
[0041] 同樣地，反應(yīng)時(shí)間也影響反應(yīng)的效率，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了 8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、32小 時(shí)、40小時(shí)和48小時(shí)的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)反應(yīng)時(shí)間為30-40小時(shí)的效率較高。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)， 紫杉醇類物質(zhì)的含量為200-300微克時(shí)較優(yōu)。
[0042] 其中優(yōu)選地：
[0043] 所述溶劑為水、PBS緩沖液、甲醇、礦物油、甲醛、二甲基亞砜和正己烷中的至少一 種。
[0044] 所述紫杉醇類物質(zhì)具有如下結(jié)構(gòu)式：
[0045]
[0046] 當(dāng)札=(：6115，1?2=0130)時(shí)，為紫杉醇；當(dāng)1? 1=(013)30)，1?2=11時(shí)，為多烯紫杉醇。
[0047] 固相載體可以是市售的已經(jīng)用馬來酸酐表面活化的用于ELISA的微孔板，如賽默 飛（Thermo Fisher Scientific Inc.)生產(chǎn)的 Pierce Amine-binding, Maleic Anhydride Activated 96孔板；也可以是常規(guī)的微孔板，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等 材質(zhì)的微孔板，然后再在微孔板的表面用馬來酸酐活化，使得馬來酸酐結(jié)合連接在微孔板 上。較優(yōu)的是米用商品名為 Pierce Amine-binding, Maleic Anhydride Activated 的 96 孔板。
[0048] 本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)紫杉醇類物質(zhì)的中間體，其包括固相載體和紫杉醇類 物質(zhì)，所述固相載體的表面結(jié)合有馬來酸酐，所述紫杉醇類物質(zhì)通過與所述馬來酸酐反應(yīng) 從而固定在所述固相載體上。
[0049] 以下以紫杉醇為例，通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
[0050] 實(shí)施例1
[0051] 紫杉醇與固相載體 Pierce Amine-binding, Maleic Anhydride Activated 96 孔 板（以下簡(jiǎn)稱孔板2)表面的結(jié)合，其反應(yīng)示意圖如圖2所示。
[0052] 具體步驟如下：
[0053] (1)配制溶液，所述溶液中含紫杉醇物質(zhì)、吡啶和溶劑，吡啶與溶劑的體積比為 2. 3%，在每毫升由吡啶和溶劑組成的液體中，紫杉醇物質(zhì)的含量為233微克。
[0054] 具體為：稱取10毫克紫杉醇，溶解于1毫升吡啶中，然后取其中的105微升與4395 微升甲醛（在其他實(shí)施例中，也可以為水、PBS緩