人臍帶間充質(zhì)干細胞與羊膜構(gòu)建細胞移植片的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及人臍帶間充質(zhì)干細胞與羊膜構(gòu)建細胞移植片 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細胞是一類具有不同分化潛能，并在非分化狀態(tài)下自我更新的細胞。干細胞治 療是指應(yīng)用人自體或異體來源的干細胞經(jīng)體外操作后輸入(或植入)人體，用于疾病治療的 過程。用于細胞治療的干細胞主要包括成體干細胞、胚胎干細胞及誘導(dǎo)的多能性干細胞。目 前國內(nèi)外已開展了多項干細胞臨床應(yīng)用研究，涉及多種干細胞類型及多種疾病類型。主要 疾病類型包括骨關(guān)節(jié)疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反應(yīng)(GVHD)、脊髓損傷及退行性神經(jīng)系 統(tǒng)疾病、眼表疾病和糖尿病等。其中許多干細胞類型，是從骨髓、脂肪組織、臍帶血、臍帶或 胎盤組織來源的間充質(zhì)干細胞，它們具有一定的多向分化潛能及抗炎和免疫調(diào)控能力等。 羊膜在一百多年前就作為一種敷料應(yīng)用于外科，上世紀初作為一種供體材料應(yīng)用于外 科皮膚移植手術(shù)中。羊膜是胎盤的最內(nèi)層，光滑，無血管、神經(jīng)及淋巴，具有一定的彈性。羊 膜具有減輕炎癥程度、縮短炎癥持續(xù)時間、抑制新生血管形成和抑制纖維化、減輕瘢痕形成 的功能。臨床上利用羊膜具有促進上皮粘附生長及增殖、減輕炎癥、抑制新生血管形成、減 少瘢痕增生、抗粘連等特性而把其應(yīng)用于嚴重急性期或陳舊性眼表燒傷的治療中去，獲得 了很好的臨床效果。
[0003] 目前，干細胞的臨床主要應(yīng)用途徑有靜脈回輸、病變部位注射、腰椎穿刺注射、導(dǎo) 管介入等，但是對于一些疾病，如角膜緣干細胞缺乏、骨關(guān)節(jié)疾病、子宮內(nèi)膜黏連等需要干 細胞在特定位置發(fā)揮作用的時候，這些應(yīng)用途徑效果欠佳。臨床治療這些疾病時需要將干 細胞固定于病變部位使其發(fā)揮作用，而且固定干細胞的附著物需不產(chǎn)生排斥反應(yīng)并能夠自 行降解。本發(fā)明就是為解決這一問題而進行研究的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 綜上所述，為了克服現(xiàn)有技術(shù)問題的不足，本發(fā)明提供了一種使用人臍帶間充質(zhì) 干細胞與人源羊膜構(gòu)建細胞移植片的方法。人臍帶間充質(zhì)干細胞英文名稱是:hUC-MSCs，本 發(fā)明將人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)接種于羊膜上，使其能夠在特定部位進行損傷修 復(fù)，彌補了單獨使用hUC-MSCs或者羊膜治療的不足，為一些難治性疾病提供了新的治療策 略，也為干細胞的臨床應(yīng)用開辟了新的治療途徑。
[0005] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 一種使用人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)和人源羊膜構(gòu)建細胞移植片的方法，它包括 如下步驟： (1) 取新鮮采集的人羊膜和臍帶，清洗后將臍帶放入生理鹽水中浸泡備用； (2) 羊膜處理:先將清洗干凈的羊膜鈍性分離掉絨毛膜，再使用生理鹽水濕潤紗布將羊 膜擦拭干凈，然后將羊膜浸泡入含青霉素 50~200U/ml和硫酸鏈霉素 50~200U/ml的生理鹽 水中浸泡0.5~1個小時后，放入無菌甘油中在2~8°C脫水，脫水時間不超過12小時，再轉(zhuǎn)入 無菌甘油中在-20 °C保存?zhèn)溆茫?(3) 將步驟(1)浸泡好的臍帶剪成1~2cm長度的小段，清洗，然后將臍帶組織轉(zhuǎn)移至培 養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加生理鹽水至淹沒臍帶組織1/2處;將臍帶一端沿靜脈血管平行方向剪 口，用組織鑷沿切口方向靜脈血管邊緣縱向撕開，將1根靜脈血管和兩根動脈血管剖離，用 組織鑷去除羊膜，撕取華通氏膠，置于加有生理鹽水的離心管中； (4) 將華通氏膠，用生理鹽水充分洗滌，然后剪碎至1~3 mm >大小，將剪碎的組織塊 均勻放置到無菌培養(yǎng)皿上，鋪平，沿培養(yǎng)皿邊緣緩慢加入5~10ml培養(yǎng)液，置于37 °C、飽和濕 度、體積分數(shù)為5%的C0:2孵箱中培養(yǎng)，每三天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)15~20天后，直至觀察 到皿底上形成多個大小不一、細胞數(shù)量密集的細胞島時，則獲得原代hUC-MSCs; (5) 將培養(yǎng)液完全移出，向原代hUC-MSCs培養(yǎng)皿中加入質(zhì)量百分比為0.05~0.25%的 胰酶1~3ml，放入37°C培養(yǎng)箱中消化，當(dāng)觀察到貼壁細胞圓縮，且已經(jīng)脫離瓶底后，加入5~ 10ml培養(yǎng)液終止消化，將懸液移至離心管中，離心棄上清，離心管中加入新培養(yǎng)液，反復(fù)吹 打至其分散為單個細胞懸液，再把細胞懸液調(diào)節(jié)成4000~6000個細胞/cm 2體系接種于培養(yǎng) 瓶中置于37°C、飽和濕度、體積分數(shù)為5%的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3~4天更換培養(yǎng)液一次，至 融合度達80~90%，即得hUC-MSCs，將細胞收獲后凍存?zhèn)溆茫?(6) 取步驟(2)中凍存的羊膜，放入無菌生理鹽水中水化10~30分鐘，將水化好的羊膜 移至無囷培養(yǎng)皿中備用； (7) 將步驟(6)制備的羊膜平鋪于羊膜載體套環(huán)上，然后移入無菌培養(yǎng)皿中，放入37°C 的C0:3孵箱中待用； (8) 將凍存的hUC-MSCs復(fù)蘇，將細胞密度調(diào)節(jié)至4000~6000個細胞/cm2體系接種于用 步驟(6 )的培養(yǎng)皿中，置于37 °C、飽和濕度、體積分數(shù)為5 %的C(b孵箱中培養(yǎng)3~5天后，細 胞融合度達80~90 %即得細胞移植片。
[0006] 進一步，所述的步驟（1)中含青霉素50~200U/ml和硫酸鏈霉素50~200U/ml的生 理鹽水是將注射用青霉素、硫酸鏈霉素按照濃度比1:1溶解入0.9%的氯化鈉注射液中得到 的。
[0007] 進一步，所述的步驟(1)、（2)和步驟(3)中的清洗均為0.9%的氯化鈉注射液清洗。 [0008] 進一步，所述的步驟(4)中的培養(yǎng)液為DMEM/F12培養(yǎng)液(購自Gibco公司）加入10~ 20%的胎牛血清所得。
[0009] 本發(fā)明的流式表型檢測包括以下步驟： ①取四根流式管，分別標記為分離傳代細胞樣本管1和分離傳代細胞樣本管2;細胞移 植片上消化下來細胞樣本管3和細胞移植片上消化下來細胞樣本管4。
[0010] ②分別將相同量的步驟(5)中分離傳代細胞和步驟(8)細胞移植片上消化下來的 細胞(有核細胞數(shù)2_5*105個)加入到相對應(yīng)標記的各流式管中，不可粘到管壁。
[0011] ③分離傳代細胞樣本管1加入CD34-FITC、CD29-PE、CD45-percp、CD44-APC;分離傳 代細胞樣本管2加入CD105-PE、CD45-percp、HLA_DR-APC;細胞移植片上消化下來細胞樣本 管3加入CD34-FITC、CD29-PE、CD45-percp、CD44-APC ;細胞移植片上消化下來細胞樣本管4 加入 CD 105-PE、CD45-per cp、HLA_DR-APC 各 5u 1，混勻。
[0012] ④室溫避光放置15分鐘，加入2mlPBS/管，1400rpm/min，離心5min。
[0013] ⑤棄上清，將管內(nèi)細胞彈起，加入0.5mlPBS，混勻，上機檢測。
[0014] ⑥上機檢測結(jié)果得:CD29、CD44、CD105表達率大于95%，為陽性；CD34、CD45、HLA-DR表達率小于2%，為陰性。
[0015] ⑦上述說明：按照制備方法分離得到的hUC-MSCs與接種于羊膜后的干細胞滿足 CD29、CD44、CD105表達率大于95%，為陽性；CD34、CD45、HLA-DR表達率小于2%，為陰性的 結(jié)果，經(jīng)鑒定為間充質(zhì)干細胞。
[0016] 本發(fā)明的無菌檢測是取步驟(8)細胞移植片培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液作為供試品，取硫 乙醇酸鹽培養(yǎng)基6支、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基4支(每支培養(yǎng)基量均為15毫升）。6支硫乙醇酸 鹽培養(yǎng)基中4支分別接種lml供試品，剩余兩支1支接種不小于lOOcfu金黃色葡萄球菌做陽 性對照，1支做陰性對照。4支胰酪大豆胨培養(yǎng)基中兩支分別接種lml供試品，剩余兩支1支接 種不小于lOOcfu白色念珠菌，1支做陰性對照。接種供試品的4支硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的 容器分兩支置于30~35° C培養(yǎng)，兩支置于20~25° C培養(yǎng)，陽性對照和陰性對照置于30~35° C培養(yǎng)。胰酪大豆胨培養(yǎng)基4支全部置于20~25° C培養(yǎng)。培養(yǎng)時間為14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀 察并記錄是否有菌生長。陽性對照在24小時內(nèi)應(yīng)有菌生長，樣品管沒有細菌及真菌生長。 (無菌檢測中的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨培養(yǎng)基均按照《中華人民共和國藥典》 2015版配制）。
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