本發(fā)明涉及牙齒根管治療，具體是指具有增強過氧化物酶活的雙金屬納米酶的制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、牙髓根尖周疾病是口腔常見疾病之一，微生物及其產(chǎn)物是導(dǎo)致其發(fā)生發(fā)展的主要病因，眾多致病微生物中，兼性厭氧的糞腸球菌具有較強的耐受力及抵抗性，是難治性根尖周炎中最常見的致病菌，檢出率達(dá)24-77％，e.faecalis進(jìn)入并定植到牙本質(zhì)小管、副根管、根尖分歧等復(fù)雜的根管系統(tǒng)中，生物膜的形成使其具有更強的存活力和致病性，同時能夠增強細(xì)菌自身的耐藥性，導(dǎo)致持續(xù)性根管感染。

2、通過根管治療術(shù)徹底清除復(fù)雜根管系統(tǒng)內(nèi)的致病微生物是治療難治性根尖周炎及長期保存患牙的基礎(chǔ)，然而機械清理難以徹底清除復(fù)雜根管系統(tǒng)內(nèi)感染的細(xì)菌，必須借助根管消毒藥物的化學(xué)作用輔助清除。

3、根管沖洗被認(rèn)為是根管治療的重要組成部分，在根管預(yù)備和沖洗過程中，沖洗劑通過沖洗針頭或其他工具注入根管，可溶解根管內(nèi)、根管壁表面和牙本質(zhì)小管內(nèi)的感染性物質(zhì)，沖洗液中所含的化學(xué)物質(zhì)可以殺死或抑制根管中的感染性微生物，溶解壞死的牙髓組織，中和毒素，去除玷污層，并作為潤滑劑，目前，臨床根管沖洗的首選藥物仍然是傳統(tǒng)根管沖洗藥物，大部分新型根管沖洗藥物仍停留在研發(fā)階段。

4、目前的根管沖洗液主要包括naclo、氯己定(chx)等，這些藥物的抗菌能力較強，但具有刺激性氣味和較差的生物相容性，甚至能夠改變牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)。

5、naclo溶液在根管治療中扮演著重要的角色，它常伴隨機械預(yù)備，并在預(yù)備完成后進(jìn)行終末沖洗，然而，使用naclo沖洗劑會對牙本質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生干擾，增加牙根折裂的可能性，需注意使用濃度和方式，以避免對組織造成的過度刺激和損傷；

6、氯己定，作為根管沖洗劑，2％的葡萄糖酸氯己定溶液能有效清除根管內(nèi)的糞腸球菌，但是，chx并不具有溶解壞死組織的能力和去除玷污層的能力，長期使用可能引起口腔菌群失調(diào)。

7、過氧化氫，雙氧水，具有強大的氧化能力，它能破壞細(xì)菌的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，生成活性氧，改變細(xì)菌的通透性，從而有效殺滅細(xì)菌，但h2o2在沖洗過程中不可加壓，否則可能引發(fā)皮下氣腫，當(dāng)與naclo聯(lián)合使用，兩者的協(xié)同作用能顯著增強抗菌消毒效果，能迅速釋放新生氧，產(chǎn)生強烈的震蕩效應(yīng)，有效清除根管內(nèi)的疏松碎屑，然而h2o2的存在會降低naclo中有效氯的含量。

8、17％edta二鈉鹽溶液被用作根管沖洗劑，edta是一種鈣螯合劑，具有低抗菌性能，edta可以清除玷污層上的礦物質(zhì)和根管壁上的碎片，但edta不能用于根管終末沖洗，因為它能與牙本質(zhì)中的鈣離子結(jié)合，導(dǎo)致牙本質(zhì)脫礦，降低牙根抗折性。

9、mtad為抗生素-有機酸-表面活性劑復(fù)合根管沖洗劑的代表，由多西環(huán)素、檸檬酸和表面活性組成，mtad中的主要抑菌成分是多西環(huán)素，它能特異性結(jié)合細(xì)菌核糖體，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，有效抑制細(xì)菌增殖，但它缺乏溶解細(xì)菌生物膜的能力；mtad對牙本質(zhì)的腐蝕非常微小，但會導(dǎo)致牙本質(zhì)呈現(xiàn)紫紅色，影響牙本質(zhì)的彈性模量，內(nèi)部壓力，對于抗力較弱的根管不適用。

10、qmix為抗菌劑-鈣螯合劑-表面活性劑組合方式典型代表，是由乙二胺四乙酸、chx和表面活性劑混合組成，但qmix沖洗根管后，會導(dǎo)致牙本質(zhì)中鈣、磷等元素含量下降，影響牙本質(zhì)的微硬度及礦化速度，進(jìn)而影響牙齒的抗折裂性。

11、由于這些根管沖洗消毒藥物都存在缺陷，因此亟需一種安全高效、有效清除復(fù)雜根管系統(tǒng)內(nèi)的致病菌和生物膜的根管消毒藥物。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述缺陷，提供具有增強過氧化物酶活的雙金屬納米酶的制備及應(yīng)用。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：具有增強過氧化物酶活的雙金屬納米酶的制備方法，包括以下步驟：

3、s1、稱取0.3063g的5-asa(5-氨基水楊酸)、0.3244g的fecl3、0.2726g的znac·2h2o溶于30ml超純水中，充分混勻，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，置入恒溫烘箱中高溫高壓反應(yīng)12h，無水乙醇、超純水交叉洗滌各3次，冷凍干燥72h；

4、s2、通過透射電子顯微鏡(tem)和場發(fā)射掃描電子顯微鏡(sem)來進(jìn)行觀察znfenps的形貌特征和分散程度,同時進(jìn)行樣品的元素分布分析，拍攝元素分布圖像，通過傅里葉紅外光譜儀，獲取了znfenps的傅里葉紅外光譜(ftir)，確定特征基團，利用x射線光電子能譜儀，對這些樣品的x射線光電子能譜(xps)和表面元素組成進(jìn)行分析，并使用thermo?advantage軟件對fe的2p、zn的2p、o1s和c1s的高分辨率光譜進(jìn)行分峰，粉末x射線衍射(xrd)用于獲取znfenps的納米衍射圖，以深入研究其晶體結(jié)構(gòu)，最后，采用納米粒度和zeta電位分析儀儀器對樣品進(jìn)行zeta電位分析，探究其表面電荷性質(zhì)，分別利用tmb和ta測試pod酶活、在不同材料濃度、時間、溫度條件下的pod酶活以及不同ph條件下的pod酶活、不同濃度的h2o2/tmb條件下pod酶動力學(xué)檢測；

5、s3、對znfenps進(jìn)行抗菌性能測試：細(xì)菌培養(yǎng)、znfenps對游離糞腸球菌的抗菌作用、znfenps對糞腸球菌生物膜的破壞作用、細(xì)菌胞內(nèi)ros水平、細(xì)菌胞內(nèi)gsh含量的變化以及細(xì)菌形貌觀察；

6、s4、znfenps體外生物相容性細(xì)胞模型的建立：先體外提取原代人牙齦成纖維細(xì)胞：將切取的牙齦迅速放入生理鹽水中，4h內(nèi)在超凈臺中用含20％青霉素-鏈霉素-兩性霉素混合液的pbs反復(fù)清洗，待完全無雜質(zhì)洗出后，2mg/ml的中性蛋白酶(dispase酶)4℃過夜消化，去除上皮組織；無菌刀片切割牙齦組織至約1mm2，3mg/mli型膠原酶，37℃消化40min，將處理后的組織重懸于含有10％fbs的α-mem完全培養(yǎng)基的t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃,5％co2培養(yǎng)，靜置7-10天后，可見長梭形、成纖維樣細(xì)胞從組織塊周圍爬出，當(dāng)細(xì)胞爬出并覆蓋約80％的瓶底時，開始細(xì)胞傳代，最終實驗選擇3-5代細(xì)胞，選擇第4代細(xì)胞，以2×106細(xì)胞/孔接種于6孔板，待其貼壁后，4％多聚甲醛固定細(xì)胞，使用抗波形絲蛋白、抗角蛋白特異蛋白抗體進(jìn)行免疫熒光染色，并在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及特異性抗體熒光顯色；

7、s5、znfenps浸提液制備及體外生物相容性評價包括細(xì)胞活性檢測：稱取5mg的znfenps在紫外線燈下照射24h后，將znfenps溶于含有10％fbs的α-mem完全培養(yǎng)基中，超聲溶解半小時，浸泡24h，制備得到znfenps浸提液，用0.22pm無菌過濾器過濾后存于15ml無菌離心管，4℃冰箱備用(保存期不超過7天)，配制所需溶液：znfenps終濃度為：20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml；h2o2終濃度為200μm；在96孔板中接種hgfs細(xì)胞懸液，100μl/孔，每孔約4×103個細(xì)胞，細(xì)胞鋪板后置于37℃，5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；待細(xì)胞貼壁后，吸除舊培養(yǎng)基，每組分別加入100μl不同濃度的znfenps浸提液，每組設(shè)置6個復(fù)孔，以加入常規(guī)培養(yǎng)基不加znfenps浸提液的有細(xì)胞孔作為對照組，以加入常規(guī)培養(yǎng)基不加znfenps浸提液的無細(xì)胞孔作為空白組，置于37℃，5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，36h；znfenps浸提液與hgfs細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)束后，吸出每孔中的舊培養(yǎng)液，所有細(xì)胞使用pbs洗滌1次，然后每孔加入100μl的α-mem完全培養(yǎng)基和10μl的cck-8液；按說明書在細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育3h后，酶標(biāo)儀450nm處測定od值，并計算hgfs細(xì)胞存活率；

8、s6、znfenps對體外感染根管模型的生物膜清除評估，模型建立：收集新鮮拔除的離體牛前牙(4-6歲)保存于pbs中，4℃冰箱儲存，選擇符合納入標(biāo)準(zhǔn)的牛牙進(jìn)行下一步實驗，去除樣本牙牙根表面的軟組織、結(jié)石后，設(shè)定根管標(biāo)準(zhǔn)長度wl＝20mm(wl＝解剖性根尖孔-1mm)，將樣本牙牙冠截除，疏通樣本牙根管，niti銼+edta凝膠預(yù)備至4錐35號，3％次氯酸鈉超聲蕩洗，根尖孔用流動樹脂封閉處理，將樣本牙裝入含有pbs的2ml的ep管中，并保持直立狀態(tài)；處理好的樣本牙分別存放于2ml的ep管中，通過高溫高壓蒸汽滅菌(121℃，30min)，隨機選取2個樣本牙檢測有無雜菌污染，另隨機選取2個樣本牙劈開后拍sem觀察根管壁玷污層是否去除和牙本質(zhì)小管開放程度，剩余經(jīng)滅菌處理后的樣本牙于60℃恒溫箱內(nèi)烘干，用無菌紙尖將樣本牙根管內(nèi)的液體拭干后，注入10μl細(xì)菌懸液(108cfu/ml)，在ep管內(nèi)加入1ml無菌bhi培養(yǎng)基和0.5ml糞腸球菌菌懸液，在37℃、co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)21天，培養(yǎng)結(jié)束后，吸除每個ep管內(nèi)的液體，隨后注入1.5ml的pbs，使用移液槍輕輕吹打，反復(fù)3次，除去殘留培養(yǎng)液。隨機選取2個樣本牙縱向劈開后拍sem觀察根管內(nèi)細(xì)菌粘附情況，3個樣本牙取根管內(nèi)菌液稀釋后涂板計數(shù)；

9、s7、znfenps對體外感染根管模型的生物膜清除評估，實驗分組及生物膜清除實驗：將樣本牙隨機分為ns(a組)、3％h2o2(b組)、3％naocl(c組)、znfenps+h2o2(d組)4組，每組5個，使用根管側(cè)方?jīng)_洗針頭進(jìn)行根管沖洗，沖洗后保留根管內(nèi)液體，37℃靜置60min，共培養(yǎng)結(jié)束后，每組使用pbs輕柔沖洗根管1次，隨機選擇各組3個樣本用于細(xì)菌稀釋涂板計數(shù)，剩余2個樣本牙劈開后通過sem觀察根冠1/3、根中1/3、根尖1/3三個不同部位的細(xì)菌及生物膜清除效果，將25號吸潮紙尖高溫高壓滅菌后烘干，分別插入每個根管至wl，靜置1min取出，放入含1.5ml的pbs中，震蕩搖勻，然后每組取20μl均勻涂板，培養(yǎng)24h，對形成的菌落計數(shù)，推算各組糞腸球菌的抑制率，將樣本牙縱向劈開(不接觸根管表面)，pbs輕柔沖洗樣本牙后，將樣本牙保存于1.5ml的2％的戊二醛中，4℃冰箱固定24h，然后進(jìn)行酒精梯度脫水(30％、50％、70％、80％、90％、100％、100％)，每次10min，真空干燥箱干燥12h。

10、進(jìn)一步地，所述s2步驟對酶的活性進(jìn)行檢測中，tmb+znfenps+h2o2在波長為650nm的時候吸光度約為1.7(652nm)，而tmb+znfenps、tmb+h2o2以及單tmb單基底時，隨著波長的增加，吸光度變化較小，且吸光度較添加znfenps后的基底，吸光度小很多，ta+znfenps+h2o2在波長為430nm左右時，熒光強度最強，說明酶活最高，相較于ta+znfenps、ta+h2o2以及單ta作為基底時，ta+znfenps+h2o2中的酶活要高很多，該pod酶隨著濃度的升高以及反應(yīng)時間的增加吸光度也會增加，當(dāng)溫度在50至60℃時，該pod酶吸光度最高，在微酸性環(huán)境中，pod酶性活躍，該pod酶活在tmb濃度為0至1mm之間的時候，酶活快速的增長，在之后呈緩慢的增長，并且增長速度逐漸減小，該pod酶活在h2o2濃度為0至1mm之間的時候，酶活快速的增長，在之后呈緩慢的增長，并且增長速度逐漸減小。

11、進(jìn)一步地，所述s3步驟中對znfenps進(jìn)行抗菌性能測試中，細(xì)菌培養(yǎng)采用糞腸球菌enterococcus?faecalis測試znfenps的抗菌性能，采用腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(bhi)培養(yǎng)基作為糞腸球菌的液體和固體培養(yǎng)基，將糞腸球菌復(fù)蘇液與凍干菌粉混勻，吸取100μl混合液均勻涂于bhi固體培養(yǎng)基上，在37℃，5％h2o2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，得到糞腸球菌第一代菌菌苔；從第一代菌種中挑取菌落，轉(zhuǎn)移至10ml的bhi液體培養(yǎng)基中，在37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8-12h，采用麥?zhǔn)媳葷醿x將得到的細(xì)菌懸液稀釋至菌濃度為106cfu/ml。

12、進(jìn)一步地，所述s3步驟中對znfenps進(jìn)行抗菌性能測試中，znfenps對游離菌的抗菌作用采用平板計數(shù)法對znfenps對游離e.faecalis(糞球腸菌)的抑菌效果進(jìn)行評估，首先，znfenps溶于雙蒸水中配成不同濃度，加入取400μl的e.faecalis懸液，使各組終濃度為0、2、10、150、20、25、30μg/ml，共孵育60min，0μg/ml的znfenps組作為對照組，接下來，各組取20μl混懸液，將其涂在bhi瓊脂板上，在37℃，5％co2培養(yǎng)箱孵育24小時，最后，對每組細(xì)菌菌落數(shù)進(jìn)行計數(shù)，每組實驗重復(fù)3次。

13、進(jìn)一步地，所述s3步驟中對znfenps進(jìn)行抗菌性能測試中，znfenps對菌斑生物膜的破壞作用，將3ml的108cfu/ml的糞腸球菌菌懸液加入12孔板中，于37℃，5％co2細(xì)菌培養(yǎng)箱靜置96h，2天后更換培養(yǎng)基，獲得糞腸球菌生物膜，隨后小心地移除bhi培養(yǎng)基，使用pbs輕柔沖洗去除浮游細(xì)菌，接著各組加入pbs、h2o2、znfenps、znfenps+h2o2溶液于細(xì)菌培養(yǎng)箱中共孵育60min；共培養(yǎng)結(jié)束后，吸出每組材料溶液，并用結(jié)晶紫染色法測定生物膜的量，每孔加入2ml的0.1％結(jié)晶紫草酸銨染色液，常溫下靜置30min后吸出，每組加入2ml的pbs輕柔沖洗1次，觀察生物膜染色情況，然后加入2ml無水乙醇溶解染料，最后加入96孔板檢測590nm處吸光度值，為了評價抗菌膜的效果，進(jìn)行了細(xì)菌活/死熒光染色實驗，將1.5ml的108cfu/ml的糞腸球菌菌懸液加入到激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，于37℃，5％co2細(xì)菌培養(yǎng)箱靜置96h，獲得糞腸球菌生物膜；輕柔吸出舊培養(yǎng)基，pbs輕柔沖洗2次，接著各組加入pbs、h2o2、znfenps、znfenps+h2o2溶液于細(xì)菌培養(yǎng)箱中共孵育60min；共培養(yǎng)結(jié)束后，吸出每組材料溶液，pbs輕柔洗滌2次，在每個孔中應(yīng)用live/death細(xì)菌活力試劑盒常溫避光下染色15分鐘，隨后各孔用pbs沖洗，使用倒置雙光子激光共聚焦掃描顯微鏡觀察染色后的生物膜。

14、進(jìn)一步地，所述s3步驟中對znfenps進(jìn)行抗菌性能測試中，細(xì)菌胞內(nèi)ros水平采用了胞內(nèi)ros探針dcfh-da，每組取原菌液0.5ml，經(jīng)3000r，5min離心獲得沉淀，pbs洗滌2次，再次離心獲得沉淀，每組(除陰性對照)加入1μl的dcfh-da探針+999μl工作液，避光條件下，37℃水浴鍋孵育45min，每3-5min顛倒搖勻1次，離心獲得沉淀，用pbs洗滌3次(3000r，5min)，去掉未進(jìn)入細(xì)胞的探針；各組依次加入pbs、h2o2、znfenps、znfenps+h2o2、陽性刺激和陰性對照試劑；于37℃水浴鍋培養(yǎng)60min，培養(yǎng)結(jié)束后離心，收集沉淀，用pbs洗滌1次，再用試劑3工作液重懸，混勻，每組取100μl加入到避光96孔板中，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm下檢測熒光強度。

15、進(jìn)一步地，所述s3步驟中對znfenps進(jìn)行抗菌性能測試中，細(xì)菌胞內(nèi)gsh含量采用了谷胱甘肽含量試劑盒：按照谷胱甘肽檢測試劑盒說明書配制一系列谷胱甘肽工作液，每組取原菌液0.5ml，經(jīng)3000r，5min離心獲得沉淀，pbs洗滌1次，再次離心獲得沉淀，各組依次加入pbs、h2o2、znfenps、znfenps+h2o2，于37℃水浴鍋培養(yǎng)60min，然后離心，收集沉淀，按照說明書加入蛋白去除試劑，37水浴/冰浴快速凍融兩次，4℃冰箱孵育5min，10000g離心收集沉淀，加入總谷胱甘肽檢測工作液，室溫孵育，最后各組取200μl加入96孔板檢測412nm處吸光度值。

16、進(jìn)一步地，所述s3步驟中對znfenps進(jìn)行抗菌性能測試中，細(xì)菌tem形貌觀察：每組取原菌液0.5ml，3000r，5min離心獲得沉淀，pbs洗滌一次，再次離心獲得沉淀，各組依次加入pbs、h2o2、znfenps、znfenps+h2o2，于37℃水浴鍋培養(yǎng)60min，培養(yǎng)結(jié)束后離心，收集沉淀，用pbs洗滌1次，加入2.5％的戊二醛溶液固定24h；通過tem觀察各組處理后糞腸球菌的形態(tài)變化。

17、進(jìn)一步地，所述s7步驟中最后通過sem觀察根冠1/3、根中1/3、根尖1/3的根管壁細(xì)菌黏附情況，使用了caron等人的評分標(biāo)準(zhǔn)，對其進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)描述。

18、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點在于：納米酶是一系列模仿酶活性的納米材料，可以持續(xù)催化通常由天然酶催化的反應(yīng)，納米酶因其顯著的穩(wěn)定性、可調(diào)的催化性能和低成本，金屬摻雜可以增強金屬元素的活性位點，從而提高過氧化物酶的活性，fe、zn是人體必需的微量元素，承擔(dān)了重要的生理作用，鐵參與體內(nèi)氧的運送和呼吸過程、造血功能、免疫功能，最常用于過氧化物酶活的活性中心，鋅化合物可以有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps)的活性，抑制膠原纖維的降解促進(jìn)鈣化的沉積，并能顯著改善牙本質(zhì)小管的力學(xué)性能，便于對牙髓、根尖周炎癥的控制，并改善微環(huán)境促進(jìn)炎癥愈合。