成，深灰色柱是指分別在TE-DGNP和TE-CT組中具有更強(qiáng)的體液應(yīng)答的小鼠的IFN- γ生成，而淺灰色柱是指分別在TE-DGNP和TE-CT組中具有平均體液應(yīng)答的小鼠的IFN- γ生成；
[0055]圖7顯示了分別在未處理的小鼠組、三次鼻內(nèi)給藥單獨(dú)的DGNP處理的小鼠組、三次鼻內(nèi)給藥單獨(dú)的TE處理的小鼠組、三次鼻內(nèi)給藥TE和DGNP混合物處理的小鼠組、三次鼻內(nèi)給藥單獨(dú)的CT處理的小鼠組和三次鼻內(nèi)給藥TE和CT混合物處理的小鼠組的小鼠腦中的囊腫數(shù)，所述囊腫數(shù)是在第三次鼻內(nèi)給藥后2周獲得的。
[0056]實驗部分
[0057]納米顆粒的制備
[0058]如前所述，多糖顆粒由美國藥典麥芽糖糊精制備(Paillard等人，2010)。簡而言之，將10g麥芽糖糊精溶于2Ν氫氧化鈉中，同時在室溫進(jìn)行磁力攪拌。此外，加入1-氯-2，3-環(huán)氧丙烷(環(huán)氧氯丙烷)和縮水甘油基三甲基氯化銨(羥膽堿，陽離子配體)以制備陽離子多糖凝膠。然后將該凝膠用乙酸中和并在高壓下在Minilab均化器(Rannie ;APV Baker，Evreux，法國)中剪切。將得到的60nm多糖納米顆粒在SGI H1-flow系統(tǒng)(空心纖維模塊(hollow fiber module):30UFIB/1S.6/40kDa ；Setric Genie Industriel,^國)中超濾以除去低分子量的試劑和鹽。所獲得的納米顆粒以下簡稱NPS。
[0059]—些前述NPS裝載有陰離子磷脂。通過注射二棕櫚酰-磷脂酰基甘油(DPPG)的乙醇溶液，將陰離子磷脂裝載到這些多孔NPS中。含有磷脂的所述多孔納米顆粒以下簡稱DGNP。這些納米顆粒的核心沒有被任何磷脂層包圍。
[0060]剛地弓形蟲的總抗原提取物(TE)的合成和純化
[0061]速殖子從連續(xù)分裂的感染的HFF細(xì)胞(人包皮成纖維細(xì)胞)獲得。從一個225cm2培養(yǎng)瓶中得到約1.1O8個速殖子，相當(dāng)于200 yg的TE。然后通過冷凍/解凍循環(huán)進(jìn)行速殖子的細(xì)胞裂解，采集、超聲(2x 1mn, 60W在冰中)并通過微量BCA方法評估蛋白的量。
[0062]TE是指根據(jù)上述操作從速殖子獲得的產(chǎn)物。TE與納米顆粒(NPS和DGNP)組合用于小鼠免疫、Elisa涂覆和細(xì)胞再刺激試驗。TE是多種抗原的混合物。
[0063]接種和NP和DGNP之間的激發(fā)方案-選擇(challenge protocol-choice)
[0064]以體液和細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度以及保護(hù)強(qiáng)度為基礎(chǔ)，測定作為抗原載體最有效的納米顆粒。
[0065]從Janvier(France)購買成年雌性Swiss和CBA/J小鼠，20_25g重合6-8周齡。該動物實驗符合法國政府的倫理與動物實驗條例。
[0066]Swiss小鼠接受鼻內(nèi)處理，以15天的時間間隔給藥三次，單獨(dú)給藥TE(1yg)和單獨(dú)給藥DGNP納米顆粒(30 μ g)(作為對照組)或組合給藥TE+NPS、TE+DGNP (10 μ g的TE和 30 μ g 的 NPS 或 DGNP)。
[0067]將各劑上述總提取物(TE)、納米顆粒及其混合物在磷酸鹽緩沖鹽水(1mM磷酸鹽，140mM NaCltPBS])中稀釋成1yl的最終體積并用微量移液器將其滴入到未經(jīng)麻醉的小鼠的鼻孔中(5 μ I/鼻孔)。在處理后I個月將經(jīng)處理的小鼠經(jīng)口感染50個76Κ弓形蟲菌株的囊腫，然后進(jìn)行隨后6周的臨床檢查。
[0068]體液免疫應(yīng)答研究
[0069]通過ELISA，將經(jīng)處理的小鼠血清中的特異性弓形蟲IgG進(jìn)行量化。連續(xù)監(jiān)測血清中抗弓形蟲抗原的IgG的生成。結(jié)果如圖1所示。
[0070]圖1顯示了光密度(DO)，其在經(jīng)處理的小鼠的血清中進(jìn)行測定。所述光密度顯示了抗剛地弓形蟲的血清IgG的水平。DGNP是指在感染前單獨(dú)用DGNP處理的小鼠，TE是指在感染前單獨(dú)用總抗原提取物(TE)處理的小鼠，TE-NPS是指在感染前用TE和NPS的混合物處理的小鼠，和TE-DGNP是指在感染前用TE和DGNP的混合物處理的小鼠。DO是指各處理組小鼠在處理前所測量的光密度。D14是指在第一次鼻內(nèi)給藥后第14天所測量的光密度，D28是指在第二次鼻內(nèi)給藥后第14天所測量的光密度和D42是指在第三次鼻內(nèi)給藥后第14天所測量的光密度。
[0071]如圖1所示，在用TE-NPS或TE-DGNP免疫的小鼠組中，第二次鼻內(nèi)給藥后可檢測到特異性的弓形蟲IgG。由第三次鼻內(nèi)給藥引起的放大效應(yīng)導(dǎo)致強(qiáng)烈地誘導(dǎo)IgG表達(dá)，但是在這兩種納米顆粒之間未觀測到顯著差異。在僅用TE處理的小鼠組中未檢測到IgG。
[0072]細(xì)胞免疫應(yīng)答研究:
[0073]為了研宄細(xì)胞免疫應(yīng)答，在第三次鼻內(nèi)給藥后第3周，對前述處理小鼠的經(jīng)弓形蟲刺激的脾細(xì)胞的上清液中的脾細(xì)胞細(xì)胞因子(一種疫苗功效的強(qiáng)免疫原性生物標(biāo)記)進(jìn)行分析。細(xì)胞因子(IFN- γ、IL-12、IL-10、IL-13、TNF- a、IL-5)通過 ELISA 進(jìn)行定量。
[0074]由于T-細(xì)胞衍生的IFN-γ還是弓形體病中保護(hù)性免疫的重要標(biāo)志，因此在弓形蟲抗原刺激后可用ELI斑點分析測定IFN-γ。
[0075]為了研宄在用TE-NPS、TE-DGNP、單獨(dú)的TE或單獨(dú)的納米顆粒處理后所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，對不同組的2只小鼠的脾的培養(yǎng)細(xì)胞的上清液評估了響應(yīng)于TE再刺激(10 μ g.ι?Γ1)的 IFN-γ、IL-10 和 IL-12 生成。
[0076]圖2顯示了獲自上述處理組小鼠的培養(yǎng)的脾細(xì)胞上清液中的IFN-γ濃度(pg/mL) ο
[0077]標(biāo)為DGNP的各柱對應(yīng)的是僅用DGNP處理的小鼠。標(biāo)為TE的各柱對應(yīng)的是僅用TE處理的小鼠。標(biāo)為TE-NPS的各柱對應(yīng)的是用TE和NPS的混合物處理的小鼠。標(biāo)為TE-DGNP的各柱對應(yīng)的是用TE和DGNP的混合物處理的小鼠。
[0078]如圖2所示，僅有一只用TE和NPS混合物免疫的小鼠通過脾細(xì)胞生成IFN-γ (175pg/ml)從而響應(yīng)于TE刺激。相對地，如圖2所示，觀測到用TE和DGNP的混合物免疫的2只小鼠的脾細(xì)胞的特異性IFN-γ生成(分別是237和375pg/ml)。因此，DGNP似乎對誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答更為有效。
[0079]用TE和DGNP的混合物處理的小鼠的腦中囊腫數(shù)的評估
[0080]在剛地弓形蟲感染后第6周，將用TE和DGNP的混合物處理并接著用剛地弓形蟲感染的小鼠處死，并采集它們的腦。
[0081]在感染后第6周，從存活小鼠采集腦并用研棒和研缽在5mL的RPMI1640中勻漿。在顯微鏡下計數(shù)在各個腦勻漿中的囊腫(10次計數(shù)，每次10 μ I)。各組結(jié)果以平均值土 SEM表示。該數(shù)據(jù)使用Mann-Whitney U檢驗(GraphPad prism軟件)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(P〈0.05)。其結(jié)果如圖3所示。
[0082]圖3顯示了在剛地弓形蟲感染前，僅用DGNP (稱為DGNP)、僅用TE (稱為TE)、用TE和NPS的混合物(稱為ΤΕ-NPS)和用TE和DGNP的混合物(稱為ΤΕ-DGNP)處理的小鼠腦中的囊腫數(shù)。
[0083]如圖3所示，用TE和DGNP的混合物處理的小鼠所具有的囊腫顯著少于分別用DGNP, TE以及TE和NPS的混合物處理的小鼠所具有的囊腫(分別是672、1333、1180和1072 ；p<0.05)。用TE和DGNP的混合物處理的小鼠腦中具有的囊腫數(shù)僅用其它處理的小鼠腦中具有的囊腫數(shù)的56%。這些數(shù)據(jù)表明，用TE和DGNP的混合物進(jìn)行的處理(免疫)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，然后降低了腦中寄生蟲的蔓延以及囊腫的形成。
[0084]根據(jù)所得結(jié)果，DGNP納米顆粒用于以下免疫實驗并用于比較DGNP和霍亂毒素(CT)的疫苗接種程序。
[0085]DGNP和霍亂毒素(CT)之間的比較
[0086]以15天的間隔，對6組各10只CBA/J小鼠分別進(jìn)行三次鼻內(nèi)