人sDR5-Fc抗體融合蛋白作為腎損傷治療藥物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及人sDR5(soluble death receptor 5，sDR5)蛋白的藥用用途，尤其是人sDR5-Fc抗體融合蛋白作為腎缺血再灌損傷急救和治療藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]缺血再灌注損傷是指器官或組織的供血中斷或減少，造成局部組織或器官缺血缺氧，再灌注后不僅不能使組織器官的功能得以恢復(fù)，反而使其缺血缺氧所致的功能和代謝障礙及機(jī)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。臨床上缺血再灌注損傷常見于器官移植、器官部分摘除、創(chuàng)傷及休克等，腎臟由于其血流高灌注的特性，缺血再灌注損傷發(fā)生率較高。
[0003]瞬間的缺血能夠造成腎臟發(fā)生可逆性的損傷，而長(zhǎng)期的缺血再灌注可以造成腎臟近曲小管遠(yuǎn)端發(fā)生不可逆的損傷。腎臟缺血再灌注損傷是臨床上常見的急性腎損傷(acutekidney injury，AKI)，是導(dǎo)致急性腎衰竭和移植腎功能喪失的主要原因之一，AKI在普通人群中的發(fā)病率約為0.5-1%，在住院患者中其發(fā)病率為5%，而在一些手術(shù)后及重癥加強(qiáng)護(hù)理病房患者中其發(fā)病率為30-50%;除了較高的發(fā)病率，AKI患者還會(huì)有很高的死亡率，約為28-90%，約為相同病情未發(fā)生AKI患者死亡率的5倍，且存活的患者亦多有不同程度的慢性腎功能不全，特別是在腎臟移植中，腎臟缺血再灌注損傷是影響移植腎臟早起存活的重要因素，可導(dǎo)致移植腎臟短期和長(zhǎng)期功能損害，包括移植腎臟原發(fā)性無(wú)功能、移植腎急性排斥反應(yīng)、慢性移植腎失功等。對(duì)此，目前尚無(wú)特殊有效的治療手段，嚴(yán)重的病例需終身腎臟替代治療。因此，如何避免腎臟發(fā)生缺血再灌注損傷，具有重要的臨床意義。
[0004]細(xì)胞對(duì)缺血缺氧、炎癥介質(zhì)等損害因素的應(yīng)答本質(zhì)上是一種應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞應(yīng)該是細(xì)胞功能受損甚至死亡的重要原因之一。在腎臟缺血再灌注損傷中，腎小管上皮細(xì)胞存在三種結(jié)局:細(xì)胞可逆性損傷、細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。隨著急性腎衰竭診斷和治療水平的提高，腎臟缺血與再灌注的間隔時(shí)間較以往明顯縮短，腎小管上皮細(xì)胞壞死在很大程度減輕，因此在目前多數(shù)情況下，腎小管上皮細(xì)胞凋亡在腎臟缺血再灌注損傷中占主導(dǎo)作用。
[0005]死亡受體5(Death receptor，DR5)與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF —related apoptosis-1nducing ligand, TRAIL)結(jié)合所激活的死亡受體通路，可通過(guò)招募相關(guān)蛋白形成DISC(death_inducing signaling complex)，進(jìn)而級(jí)聯(lián)式活化Caspase_8、3等，引起細(xì)胞凋亡。全長(zhǎng)的DR5是含有411個(gè)氨基酸的I型跨膜糖蛋白?？扇苄运劳鍪荏w5(soluble DR5，sDR5)因缺乏跨膜區(qū)域不能在細(xì)胞膜上表達(dá)而被分泌至細(xì)胞外。sDR5在正常人外周血中表達(dá)較低，因其具有與TRAIL配體相結(jié)合的胞外段完整結(jié)構(gòu)，可與細(xì)胞膜上的死亡受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TRAIL分子，從而阻斷TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
[0006]有研究表明:sDR5可通過(guò)阻斷TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)減輕乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的肝細(xì)胞損傷(參見:Yu-Gang Liu , Su-Xia Liu , Xiao-Hong Liang et al.Blockade of TRAIL pathway amel1rates HBV-1nduced hepatocyte apoptosis in anacute hepatitis model.B1chemical and B1physical Research Communicat1ns352 (2007) 329-334)及改善因缺血造成的中樞系統(tǒng)損傷(參見:Min Cui，Limei Wang，Xiaohong Liang et al.Blocking TRAIL-DR5 signaling with soluble DR5 reducesdelayed neuronal damage after transient global cerebral ischemia.Neurob1logy of Disease 39 (2010) 138-147)。目前，sDR5對(duì)于同樣因缺血引起的腎組織損傷是否存在治療作用，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。
[0007]腎缺血及血運(yùn)重建后再灌注損傷的發(fā)生與腎小管上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡密切相關(guān)，針對(duì)凋亡發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，利用sDR5-Fc與膜型DR5競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TRAIL，使TRAIL不能啟動(dòng)凋亡程序的發(fā)生，這樣可減少腎組織損傷，改善患者長(zhǎng)期預(yù)后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于研究人sDR5-Fc抗體融合蛋白通過(guò)阻斷/封閉TRAIL-死亡受體通路來(lái)減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用，并進(jìn)一步提供人sDR5-Fc融合蛋白作為腎損傷治療藥物的應(yīng)用。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
人sDR5-Fc抗體融合蛋白作為腎損傷治療藥物的應(yīng)用，如，可以是作為急性腎損傷或腎缺血-再灌注損傷治療藥物的應(yīng)用，也可以是作為急性腎功能衰竭或腎移植排斥治療藥物的應(yīng)用。
[0010]人SDR5-FC抗體融合蛋白在制備阻斷TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。所述人sDR5-Fc抗體融合蛋白通過(guò)阻斷TRAIL/DR5通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，來(lái)減少腎組織損傷，以達(dá)到保護(hù)腎臟細(xì)胞的作用。
[0011]人sDR5_Fc抗體融合蛋白的蛋白序列、序列修飾及相關(guān)生物工程產(chǎn)品在制備治療腎缺血-再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。
[0012]人sDR5-Fc抗體融合蛋白與其它藥物在腎缺血-再灌注損傷中的協(xié)同治療應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO細(xì)胞來(lái)源的人sDR5-Fc抗體融合蛋白，在C57BL/6小鼠腎缺血再灌注模型中測(cè)試了人sDR5-Fc抗體融合對(duì)腎缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用，分別獲得人sDR5-Fc抗體融合能夠減少腎缺血再灌注損傷程度、降低腎小管上皮細(xì)胞凋亡率，改善腎功能的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌注24小時(shí)模型中，再灌注2h/6h時(shí)，按照15.0 mg/kg的劑量，通過(guò)單次腹腔注射sDR5-Fc抗體融合蛋白，用藥組與對(duì)照組相比均可明顯減少腎缺血再灌注損傷程度。另外，人sDR5-Fc抗體融合蛋白可明顯降低缺血模型中腎小管上皮細(xì)胞凋亡率。
[0014]本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí):人sDR5-Fc抗體融合蛋白能阻斷TRAIL/DR5通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減少腎缺血再灌注損傷程度，達(dá)到保護(hù)腎臟的作用，對(duì)腎缺血和再灌注損傷有治療作用，作為新型候選藥物極具開發(fā)潛力和臨床應(yīng)用前景。
[00?5]為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)及本發(fā)明所述人sDR5_Fc抗體融合蛋白的作用效果，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明在制備治療腎缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了理解和說(shuō)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員或其他人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)其做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1純化的人sDR5_Fc蛋白純化前后考馬斯亮藍(lán)染色；
圖2純化的人sDR5-Fc蛋白對(duì)TRAIL誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的阻斷效應(yīng);200 ng TRAIL單獨(dú)或與500 ng人sDR5-Fc蛋白同時(shí)加入5 X 16 Jurkat細(xì)胞，24小時(shí)后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，加入培養(yǎng)基組作為對(duì)照；
圖3小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌2h給藥模型各組腎功能檢測(cè)結(jié)果;A:尿素氮檢測(cè)結(jié)果;B:血肌酐檢測(cè)結(jié)果
圖4小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌2h給藥模型各組腎臟組織HE染色結(jié)果；
圖5小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌2h給藥模型腎臟組織免疫組化DR5檢測(cè)結(jié)果；
圖6小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌2h給藥模型腎臟組織免疫組化TRAIL檢測(cè)結(jié)果；
圖7小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌2h給藥模型腎臟組織免疫組化Caspase-3檢測(cè)結(jié)果；圖8小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌2h給藥模型腎臟組織免疫組化Caspase-8檢測(cè)結(jié)果；圖9小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌6h給藥模型各組腎功能檢測(cè)結(jié)果;A:尿素氮檢測(cè)結(jié)果;B:血肌酐檢測(cè)結(jié)果；
圖10小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌6h給藥模型各組腎臟組織HE染色結(jié)果；
圖11小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌6h給藥模型腎臟組織免疫組化DR5檢測(cè)結(jié)果；
圖12小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌6h給藥模型腎臟組織免疫組化TRAIL檢測(cè)結(jié)果；
圖13小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌6h給藥模型腎臟組織免疫組化Caspase-3檢測(cè)結(jié)果； 圖14小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌6h給藥模型腎臟組織免疫組化Caspase-8檢測(cè)結(jié)果； 圖15小鼠雙側(cè)腎缺血22分鐘再灌6h給藥模型腎臟組織免疫組化TUNEL檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
[0018]實(shí)施例1:人sDR5_Fc抗體融合蛋白的制備
將 DR5 胞外段基因序列(182 個(gè)氨基酸，http: //www.uniprot.0rg/uniprot/014763)克隆入帶人IgG Fe段的真核表達(dá)載體pGS-Fc中，設(shè)計(jì)引物為:sense(5’-3’):ggaagcttgccaccATG GAA CAA CGG GGA CAG，antisense(5’_3’): aagaattcTCT GGT CGTGGT GCA GGG。提取高純度質(zhì)粒(OMEGA Plasmid Midi Kit)并調(diào)整濃度為500 ng/μ?。復(fù)蘇CH0/KI細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)至最佳，瞬時(shí)電轉(zhuǎn)(300v，間隔時(shí)間0.125s，持續(xù)時(shí)間0.1ms，電擊三次)，經(jīng)MSX加壓篩選得到高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株。目前本發(fā)明融合蛋白產(chǎn)量可達(dá)到1.9g/L。用純化后的蛋白進(jìn)行體外功能驗(yàn)證，檢測(cè)其是否可以阻斷TRAIL誘導(dǎo)的人白血病細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞凋亡。
[0019]圖1顯示該抗體融合蛋白sDR5_Fc純度以及大小，說(shuō)明該融合蛋白大小45kd，純度大于90%。
[0020]圖2顯示人sDR5_Fc在Jurkat細(xì)胞中凋亡信號(hào)阻斷效應(yīng)。流式結(jié)果顯示:當(dāng)同時(shí)加入TRAIL和sDR5-Fc后，細(xì)胞凋亡情況與正常不作處理組(圖中以Normal表示)類似，而只加TRAIL組則細(xì)胞凋亡比較嚴(yán)重，因此說(shuō)明sDR5-Fc具有良好的阻斷效應(yīng)。
[0021]實(shí)施例2:人sDR5-Fc抗體融合蛋白在腎缺血再灌損傷中保護(hù)作用腎缺血再灌注損傷小鼠動(dòng)物模型的建立
清潔級(jí)6-8周齡雄性C57BL/6小鼠，稱重后，腹腔注射5%水合氯醛(7.5ml/kg)麻醉，將小鼠放置恒溫臺(tái)上，小鼠背部去毛，暴露皮膚，待小鼠體溫恢復(fù)到36°C后開始實(shí)施手術(shù)，在小鼠肋骨下方，脊柱兩側(cè)分別打開I cm左右的小口，小鼠的左腎比右腎偏低，故左腎的小口要略向下，再剪開肌肉層，用棉花棒輕輕將腎臟擠出傷口，暴露出兩腎；右腎的腎蒂略短，首先用動(dòng)脈夾夾住右腎，再立刻夾住左腎，左右腎夾閉時(shí)間差不超過(guò)2min，兩腎的顏色由鮮紅逐漸變成深紅色，夾閉時(shí)間設(shè)置為22min，將兩腎放