入體內(nèi)或者用浸潤(rùn)生理鹽水的紗布覆蓋在小鼠背部，22min后松開動(dòng)脈夾，可以看出腎臟顏色又逐步變成鮮紅色(參見:QingqingWei and Zheng Dong, Mouse model of ischemic acute kidney injury: technicalnotes and tricks.Am J Phys1l Renal Phys1l.2012; 303: 1487-1494.)。分別縫合肌肉層和皮膚，待小鼠在恒溫臺(tái)上清醒后放回鼠籠，在再灌注2h/6h腹腔注射sDR5-Fc抗體融合蛋白，24h后取血，分離血清，并取腎臟標(biāo)本。
[0022]將進(jìn)行腎蒂結(jié)扎的小鼠隨機(jī)分組，分為正常組(圖中以Normal表示)、假手術(shù)組(圖中以Sham表示)、PBS組和人sDR5-Fc組，每組根據(jù)劑量不同再分為三小組，每小組至少6只小鼠，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，具體實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果敘述如下:
在腎蒂結(jié)扎后22min，再灌注2h/6h時(shí)，按照15.0 mg/kg的劑量，人sDR5_Fc組通過小鼠腹腔注射濃度為2.16mg/ml的融合蛋白0.15 ml。
[0023](I)小鼠腎功能檢測(cè)
心臟取血，3000 rpm離心1min，取血清，一 20度保存，送至河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)(日本奧林巴斯全自動(dòng)生化分析儀)尿素氮和血肌酐。
[0024]圖3顯示假手術(shù)組以及正常組小鼠血清尿素氮和肌酐值均較低且無顯著性差異；雙側(cè)腎臟缺血22min再灌2h PBS對(duì)照組，血清尿素氮和肌酐值升高明顯，與假手術(shù)組與正常組差異顯著；在缺血22min再灌2h注射sDR5-Fc抗體融合蛋白組，血清尿素氮和肌酐值都有明顯下降，且與正常組和假手術(shù)組差異不顯著，與PBS對(duì)照組具有顯著性差異，說明sDR5-Fc抗體融合蛋白在小鼠雙側(cè)腎臟缺血22min再灌2h具有顯著的保護(hù)作用。
[0025]圖9顯示小鼠雙側(cè)腎臟缺血22min再灌6h給藥組腎功能檢測(cè)結(jié)果，與圖3類似，說明sDR5-Fc抗體融合蛋白在小鼠雙側(cè)腎臟缺血22min再灌6h同樣具有顯著的保護(hù)作用。
[0026](2)小鼠腎臟形態(tài)學(xué)觀察一一HE(蘇木精-伊紅染色法)染色
小鼠腎臟組織固定在4%多聚甲醛中超過48小時(shí)后，調(diào)整位置放入包埋框內(nèi)，并用2B鉛筆標(biāo)記清楚名稱。用清水沖洗30min，將裝有組織的包埋框放入自動(dòng)包埋機(jī)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋處理。程序設(shè)置如下:70%乙醇，2.5h—85%乙醇，lh—95%乙醇I，lh—95%乙醇II，lh—100%乙醇I，lh—100%乙醇11，lh—二甲苯I，45!11；[114二甲苯11，45min—石錯(cuò)I，lh—石蠟II，lh—石蠟m，45min。將組織從最后的石蠟盒里取出，放在包埋機(jī)里(提前打開包埋機(jī)使里面的石蠟熔化)，將組織置入充滿熔化石蠟的模具盒中，組織完整包埋在蠟塊中，放在凍臺(tái)上快速冷卻，組織蠟塊包埋成功。用石蠟切片機(jī)將蠟塊切成4μπι的連續(xù)切片，置于40°C溫水，當(dāng)切片展開，無皺紋時(shí)，貼在防脫載玻片上，每張玻片上貼兩份組織，以做對(duì)照。在370C烤片機(jī)上烤片I小時(shí)左右，放片盒中保存。
[0027]①62。(:烤片3011^11。
[0028]②脫蠟至水:二甲苯1、I1、III，各1min—由高到低梯度酒精脫水(100%無水乙醇
1、11—95%乙醇—85%乙醇—75%乙醇)，各5min—ddH20 1、II，各5min。
[0029]③蘇木素染核:蘇木素染色1min，流水3min洗去蘇木素浮色，1%鹽酸酒精2sec，流水沖洗泛藍(lán)15min—PBS1、I1、III，各5min。
[0030]④伊紅染色:伊紅染色l-3min4PBS1、I1、III，各5min。
[0031]⑤脫水:85%乙醇，2sec—95%乙醇，5min—100%無水乙醇I，5min—100%無水乙醇II，5mim。
[0032]⑥透明:二甲苯I，10min—二甲苯II，10min—二甲苯III，10min。
[0033]⑦封片:中性樹膠封固。
[0034]將各組取下的腎臟組織石蠟包埋切片進(jìn)行HE染色，觀察并拍照。
[0035]從圖4可以看出:正常組以及假手術(shù)組的腎小球以及周圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，sDR5-Fc組形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)與正常組與假手術(shù)組相似，沒有明顯的細(xì)胞壞死，而PBS組腎小球有變性以及壞死情況，因此雙側(cè)腎臟缺血22min再灌2h，sDR5_Fc對(duì)腎臟具有明顯的保護(hù)作用。
[0036]圖10顯示雙側(cè)腎臟缺血22min再灌6h，sDR5-Fc對(duì)腎臟具有顯著的保護(hù)作用。
[0037](3)免疫組化觀察細(xì)胞凋亡
將腎臟組織進(jìn)行勻漿，提取總蛋白，通過免疫組化檢測(cè)TRAIL、DR5、Caspase-3以及Caspase-8的表達(dá)情況。
[0038]I)免疫組化用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(SABC法)具體步驟如下: 2)脫蠟、水化。
[0039]3)將組織切片放入60 0C烤箱中烤片2小時(shí)。
[0040]4)從烤箱取出的切片立即置于二甲苯I浸泡lOmin—二甲苯II，10min—二甲苯III，1min0
[0041 ] 5)無水乙醇I，5min—無水乙醇II，5min—95%乙醇I，5min—95%乙醇II，5min—85%乙醇，5min—70%乙醇，5min—60%乙醇，5min—dd H20，5min。
[0042]6)PBS I，5min—PBS II，5min—PBS III，5min。
[0043]7 )用新配制的3%H202避光室溫封閉1min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶。
[0044]8)PBS I，5min—PBS II，5min—PBS III，5min。
[0045]9)抗原修復(fù)。將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中，放微波爐內(nèi)用高火加熱至沸騰，暫停2分鐘，再以中高火加熱20sec，暫停2分鐘，中高火再次加熱20sec，如此重復(fù)，共10分鐘。將裝有切片的枸櫞酸鹽組化盒從微波爐內(nèi)取出，放室溫自然晾涼。
[0046]10)當(dāng)恢復(fù)至室溫時(shí)，PBS I，5min—PBS II，5min—PBS III，5min。
[0047]11)甩去多余液體，在每片組織上滴加50μ1 SABC試劑盒中的5%BSA試劑，室溫30mino
[0048]12)甩去多余液體，用試劑盒內(nèi)的5%BSA做一抗稀釋液，每個(gè)組織上滴加50μ1稀釋好的抗體，放濕盒4 0C孵育過夜。
[0049]13)免疫組化SABC法檢測(cè)DR5蛋白表達(dá)，一抗稀釋比例1: 200。
[0050]免疫組化SABC法檢測(cè)TRAIL蛋白表達(dá)，一抗稀釋比例1: 200。
[0051 ] 免疫組化SABC法檢測(cè)Cleaved Caspase 3蛋白表達(dá)，一抗稀釋比例1: 2000。
[0052]免疫組化SABC法檢測(cè)Cleaved Caspase 8蛋白表達(dá)，一抗稀釋比例1: 200。
[0053]14)甩去一抗，PBS 1、I1、III，各洗3次，5min/次。
[0054]15)甩干，每片組織上滴加50μ1生物素化二抗，放濕盒室溫孵育I小時(shí)。
[0055]16)甩去生物素化二抗，用PBS Ι、ΙΙ、ΙΙΙ，各洗3次，5min/次。
[0056]17)甩干，每片組織上滴加50μ1 SABC，放濕盒室溫孵育I小時(shí)。
[0057]18)甩去SABC，用PBS Ι、ΙΙ、ΙΙΙ，各洗3次，5min/次。
[0058]19 )配制DAB(或AEC)顯色液，甩干玻片，滴加DAB(或AEC)顯色液，在鏡下控制顯色情況。
[0059]20)用自來水終止顯色。PBS 1、I1、III，各洗3次，5min/次。
[0000]21)蘇木素復(fù)染5min，自來水水沖lOmin。鹽酸酒精分化，3sec，自來水沖洗lOmin。[0061 ] 22)脫水。60%乙醇、75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇1、II，依次各浸泡5分鐘。
[0062]23)透明。二甲苯1、I1、III，各浸泡lOmin。
[0063]24)中性樹膠封片，在組織上滴ΙΟμΙ中性樹膠，取蓋玻片從一側(cè)緩慢壓下，避免生成氣泡，室溫保存。
[0064]圖5-8顯示小鼠雙側(cè)腎臟缺血22min再灌2h各組免疫組化結(jié)果.其中圖5、6分別顯示DR5和TRAIL在PBS組的腎臟組織表達(dá)較多，而在正常組、假手術(shù)組以及sDR5-Fc組表達(dá)較少，說明PBS組腎臟組織細(xì)胞表面具有DR5的表達(dá)進(jìn)而引起一系列的反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而sDR5-Fc組則通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TRAIL，阻斷了 DR5與TRAIL向傳遞調(diào)亡誘導(dǎo)信號(hào)，從而抑制了細(xì)胞凋亡。圖7、8分別顯示Caspase3以及Caspase8的表達(dá)結(jié)果。均顯示在PBS組的腎臟細(xì)胞內(nèi)具有Caspase3以及Caspase8的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的調(diào)亡。
[0065]圖5-8說明小鼠雙側(cè)腎臟缺血22min再灌2h，sDR5-Fc對(duì)腎臟具有顯著的保護(hù)作用。
[0066]圖11-14顯示小鼠雙側(cè)腎臟缺血221^11再灌611各組免疫組化結(jié)果，與缺血2211^11再灌2h給藥組類似，同時(shí)圖15顯示PBS組具有細(xì)胞凋亡引起的DNA斷裂情況，因此圖5-8和圖
11-15說明sDR5-Fc對(duì)腎臟具有顯著的保護(hù)作用。
[0067]結(jié)論:sDR5-Fc對(duì)小鼠缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.人SDR5-FC抗體融合蛋白作為腎損傷治療藥物的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述人sDR5-Fc抗體融合蛋白作為急性腎損傷或腎缺血-再灌注損傷治療藥物的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述人sDR5-Fc抗體融合蛋白作為急性腎功能衰竭或腎移植排斥治療藥物的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求1至3任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述人sDR5-Fc抗體融合蛋白通過阻斷TRAIL/DR5通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，來減少腎組織損傷，以達(dá)到保護(hù)腎臟細(xì)胞的作用。5.人sDR5-Fc抗體融合蛋白的蛋白序列、序列修飾及相關(guān)生物工程產(chǎn)品在制備治療腎缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及人sDR5（可溶性死亡受體5，soluble DR5，簡(jiǎn)稱sDR5）與人免疫球蛋白Fc段融合組成的sDR5-Fc抗體融合蛋白的藥用用途，尤其是人sDR5-Fc抗體融合蛋白作為腎損傷治療藥物的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：人sDR5-Fc抗體融合蛋白在小鼠腎缺血模型和缺血-再灌注模型中可明顯減少腎組織損傷，并顯著降低腎小管上皮細(xì)胞凋亡率。本發(fā)明作為治療急性腎損傷的新型候選藥物，極具開發(fā)潛力。
【IPC分類】A61K38/17, A61P9/00, A61P13/12
【公開號(hào)】CN105688189
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610041751
【發(fā)明人】馬遠(yuǎn)方, 王志增, 張軍, 王耀輝, 李小全
【申請(qǐng)人】河南大學(xué)
【公開日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2016年1月21日