本發(fā)明屬于分子量為43kda的反式激活應(yīng)答dna結(jié)合蛋白(tardb或也為tdp-43)的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及人源化tdp-43特異性結(jié)合分子、特別是人源化抗tdp-43抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物及其用途。本發(fā)明提供了診斷、預(yù)防、減輕和/或治療與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病(proteinopathy)的手段和方法，所述疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病包括但不限于額顳癡呆(frontotemporal?dementia，ftd)、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic?lateral?sclerosis，als)、阿爾茨海默病(alzheimer’s?disease，ad)、帕金森病(parkinson’s?disease，pd)、慢性創(chuàng)傷性腦病(chronic?traumatic?encephalopathy，cte)和邊緣主導(dǎo)年齡相關(guān)性tdp-43腦病(limbic-predominant?age-related?tdp-43encephalopathy，late)。

背景技術(shù)：

1、以蛋白質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central?nervous?system，cns)(蛋白質(zhì)病)和外周器官中病理性聚集為特征的年齡相關(guān)性腦病是世界上失能和死亡率的主要原因之一。形成聚集體的最佳表征的蛋白質(zhì)是阿爾茨海默病和相關(guān)障礙中的β淀粉樣蛋白。導(dǎo)致神經(jīng)變性的其他疾病相關(guān)的、傾向于聚集的蛋白質(zhì)包括但不限于tau、α-突觸核蛋白(asyn、a-syn)、亨廷頓蛋白(huntingtin)、肉瘤融合蛋白(fused?in?sarcoma，fus)、通過c9orf72重復(fù)擴(kuò)增的非常規(guī)翻譯產(chǎn)生的二肽重復(fù)蛋白(dipeptide?repeat?protein，dpr)、超氧化物歧化酶1(superoxide?dismutase?1，sod1)和tdp-43。涉及tdp-43聚集體的疾病通常被列為tdp-43蛋白質(zhì)病，包括但不限于als和ftd。

2、i.tdp-43介紹

3、反式激活應(yīng)答(transactive?response，tar)dna結(jié)合蛋白43kda(tdp-43)是由染色體1p36.2(als10)上的tardbp基因編碼的具有414個氨基酸的蛋白質(zhì)。tardbp由六個外顯子(外顯子1是非編碼的；外顯子2至6是蛋白質(zhì)編碼的)構(gòu)成。tdp-43屬于異質(zhì)核糖核蛋白(hnrnp)rna結(jié)合蛋白家族(wang?et?al.,trends?in?molecular?medicine?vol.14no.11,2008,479-485；lagier-tourenne?et?al.,human?molecular?genetics,2010,vol.19,review?issue?1r46-r64)。tdp-43包含五個功能結(jié)構(gòu)域(warraich?et?al.,theinternational?journal?of?biochemistry&cell?biology?42(2010)1606–1609，圖1)：兩個rna識別基序(rrm1和rrm2)，其具有兩個高度保守的六聚核糖核蛋白2(rnp2)和八聚核糖核蛋白1(rnp1)區(qū)域；核輸出信號(nuclear?export?signal，nes)和核定位信號(nuclearlocalization?signal，nls)，使其能夠在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，轉(zhuǎn)運結(jié)合的mrna；以及位于c末端的富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域，其介導(dǎo)蛋白質(zhì)間相互作用。tdp-43涉及rna加工的多個方面，包括轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運和穩(wěn)定化(buratti?and?baralle,febs?journal?277(2010)2268–2281)。tdp-43是高度保守、普遍表達(dá)且表達(dá)水平嚴(yán)格自調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，其不斷在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，但主要定位于細(xì)胞核。2006年，tdp-43被鑒定為在絕大部分具有tau陰性、泛素陽性包涵體的額顳葉變性(frontotemporal?lobar?degeneration，ftld)(之后稱為ftld-tdp)的病例中，以及在大多數(shù)肌萎縮側(cè)索硬化(als)病例中積累的蛋白質(zhì)(araiet?al.,biochemical?and?biophysical?research?communications?351(2006)602–611；neumann?et?al.,science?314,(2006),130-133)。

4、已在散發(fā)性和家族性als患者以及患有遺傳性ftd的患者中鑒定了38個tdp-43負(fù)顯性突變，其主要位于富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域中(lagier-tourenne?and?cleveland,cell136,2009,1001-1004，圖1)。tdp-43本質(zhì)上是傾向聚集的，如沉降測定所示，并且這種傾向由于一些als相關(guān)的tardbp突變而進(jìn)一步提高(ticozzi?et?al.,cns?neurol.disord.drugtargets.2010,9(3),285-296.)使tdp-43聚集與臨床疾病表現(xiàn)相聯(lián)系。ii.神經(jīng)變性中的tdp-43

5、已在越來越多的神經(jīng)退行性病癥中鑒定出tdp-43聚集體(lagier-tourenne?etal.,human?molecular?genetics,2010,vol.19,review?issue?1r46-r64)，包括但不限于：額顳癡呆(ftd，例如散發(fā)性或家族性、伴有或不伴有運動神經(jīng)元疾病(motor-neurondisease，mnd)、有顆粒蛋白前體(grn)突變、有c9orf72突變、有tardbp突變、有含纈酪肽蛋白(valosine-containing?protein，vcp)突變、與9p染色體連鎖、皮質(zhì)基底節(jié)變性、有泛素陽性tdp-43包涵體的額顳葉變性(ftld)(ftld-tdp)、嗜銀顆粒病(argyrophilic?graindisease)、皮克病(pick’s?disease)、語義變異型原發(fā)性進(jìn)行性失語(semantic?variantprimary?progressive?aphasia，svppa)、行為變異型ftd(behavioural?variant?ftd，bvftd)、非流利性變異型原發(fā)性進(jìn)行性失語(nonfluent?variant?primary?progressiveaphasia，nfvppa)，等)、肌萎縮側(cè)索硬化(als，例如散發(fā)性als、有tardbp突變、有血管生成蛋白(angiogenin，ang)突變)、亞歷山大病(alexander?disease，axd)、邊緣主導(dǎo)年齡相關(guān)性tdp-43腦病(late)、慢性創(chuàng)傷性腦病(cte)、佩里綜合征(perry?syndrome)、阿爾茨海默病(ad，包括散發(fā)性和家族性形式的ad)、唐氏綜合征(down?syndrome)、家族性英國型癡呆(familial?british?dementia)、多聚谷氨酰胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型(sca3(spinocerebellar?ataxia?type3)；也稱為馬-約病(machado?joseph?disease)))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發(fā)性包涵體肌炎；包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(vcp)突變；以及佩吉特骨病(paget?disease?of?bone)和額顳癡呆)；有鑲邊空泡的眼咽肌營養(yǎng)不良；有肌收縮蛋白(myot)基因突變或編碼結(jié)蛋白(des)之基因的突變的肌原纖維肌病、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic?brain?injury，tbi)、路易體癡呆(dementia?with?lewy?body，dlb)或帕金森病(pd)。術(shù)語late旨在涵蓋與tdp-43蛋白質(zhì)病相關(guān)的幾個先前使用的名稱，這些名稱可能與認(rèn)知損害相關(guān)，包括海馬硬化、衰老性海馬硬化、海馬硬化性癡呆、腦年齡相關(guān)性tdp-43及硬化(carts)，和老年人中的tdp-43病理狀況(綜述參見kuslansky?et?al.，2004；lippaand?dickson，2004；nelson?et?al.，2013，2016b；dutra?et?al.，2015)。

6、來自患者腦的聚集tdp-43顯示出大量異常修飾，包括過度磷酸化、泛素化、乙?；屯ㄟ^蛋白水解切割的c末端片段(arai?et?al.,biochemical?and?biophysicalresearch?communications?351(2006)602–611；neumann?et?al.,science?314,(2006),130-133；neumann?et?al.,acta?neuropathol.(2009)117:137–149；hasegawa?et?al.,(2008)annals?of?neurology?vol?64no?1,60–70；cohen?et?al.,nat?commun.6:5845,2015)。tdp-43病理狀況的另一個特征性特征是tdp-43從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的重分布和積累。ftld-tdp的標(biāo)志性病變是神經(jīng)元胞質(zhì)包涵體和膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)包涵體(分別為nci(neuronalcytoplasmic?inclusion)和gci(glial?cytoplasmic?inclusion))和營養(yǎng)不良性神經(jīng)突(dystrophic?neurite，dn)，其對tdp-43以及泛素和p62具有免疫反應(yīng)性，但對其他神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白呈陰性。包涵體形態(tài)及其組織分布的差異與特定突變和/或臨床表現(xiàn)相關(guān)。迄今為止，通過組織學(xué)分類描述了四種類型的tdp-43病理狀況(mackenzie?andneumann,j.neurochem.(2016)138(增刊1),54-70)。ftld-tdp?a型病例的特征在于大量的短的營養(yǎng)不良性神經(jīng)突(dystrophic?neuritis，dn)和緊湊的橢圓形或新月形nci，主要在新皮質(zhì)ii層(mackenzie?et?al.,2016j.neurochem.138(增刊1),54–70，圖2f)。這種病理的情況通常在臨床上在行為變異型額顳癡呆(bvftd)或非流利性/語法變異型原發(fā)性進(jìn)行性失語(nfvppa)的情況下出現(xiàn)，并且與顆粒蛋白前體(grn)突變相關(guān)。b型病例在淺表和深皮質(zhì)層二者中均顯示出中等數(shù)目的緊湊或顆粒狀nci，且具有相對較少的dn和nii(神經(jīng)元核內(nèi)包涵體(neuronal?intranuclear?inclusion)；mackenzie?et?al.,2016j.neurochem.138(增刊1),54–70，圖2g)。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)同時出現(xiàn)ftd和als癥狀的病例具有ftld-tdp?b型病理。c型病例有大量長而彎曲的神經(jīng)突，主要在淺表皮質(zhì)層中，具有很少或沒有nci(mackenzie?et?al.,2016j.neurochem.138(增刊1),54–70，圖2j)。這種病理特別地在出現(xiàn)語義變異型原發(fā)性進(jìn)行性失語(svppa)的病例中發(fā)現(xiàn)。ftld-tdp?d型顯示在新皮質(zhì)層中具有豐富的豆?fàn)钌窠?jīng)元核內(nèi)包涵體(nii)和短的dn，且具有僅稀少的nci(mackenzie?et?al.,2016j.neurochem.138(增刊1),54–70，圖2k)。e型的特征在于：除白質(zhì)中的曲線性少突膠質(zhì)細(xì)胞包涵體之外還有顆粒絲狀神經(jīng)元包涵體(granulofilamentousneuronal?inclusion，gfni)和非常細(xì)的點狀神經(jīng)氈聚集體，其影響所有新皮質(zhì)層(edwardb.lee?et?al.,acta?neuropathol.2017july；134(1):65–78.)。這種病理模式僅在vcp與包涵體肌炎相關(guān)的病例中發(fā)現(xiàn)。

7、iii.ftd中的tdp-43

8、額顳癡呆(ftd)是一個臨床術(shù)語，其涵蓋基于額和顳葉的變性-稱為額顳葉變性(ftld)的病理性特征的廣譜障礙。ftd是65歲以下年齡組中早期退行性癡呆的第二大最主要原因(le?ber,revue?neurologique169(2013)811-819)。ftd表現(xiàn)為數(shù)種綜合征，包括以人格和行為變化為特征的bvftd；以語言功能變化為特征的語義癡呆(semantic?dementia，sd)和進(jìn)行性非流利性失語(progressive?nonfluent?aphasia，pnfa)；以運動功能障礙為特征的皮質(zhì)基底節(jié)綜合征(corticobasal?syndrome，cbs)、進(jìn)行性核上性麻痹綜合征和運動神經(jīng)元疾病(ftd-mnd)。這些綜合征的臨床診斷復(fù)雜并且最終結(jié)論只能通過進(jìn)行死后組織病理學(xué)分析以檢測聚集的蛋白質(zhì)并確定受影響的腦區(qū)域而得出。就病理性蛋白質(zhì)包涵體而言，約45％的病例顯示出錯折疊tau的病理性積累，45％的病例具有病理性tdp-43并且較小的亞組具有fus和其他蛋白質(zhì)的聚集體。

9、iv.als中的tdp-43

10、肌萎縮側(cè)索硬化(als)是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征在于上和下運動神經(jīng)元的過早喪失。als的進(jìn)展以致命性麻痹和呼吸衰竭為特征，其病程從診斷到死亡為1至5年。在大多數(shù)散發(fā)性als病例中，該神經(jīng)病理的特征在于初級運動皮質(zhì)、腦干運動核、脊髓和相關(guān)白質(zhì)道的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中tdp-43的異常細(xì)胞質(zhì)積累。伴有癡呆的als涉及運動外新皮質(zhì)和海馬中tdp-43的積累。tdp-43磷酸化在als患者中的作用已借助于抗體進(jìn)行了探索，所述抗體與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)包涵體中磷酸化tdp-43特異性結(jié)合，其中氨基酸s379、s403、s404、s409、s410為tdp-43磷酸化的主要位點(hasegawa?et?al.,ann?neurol?2008；64:60–70；neumann?et?al.,acta?neuropathol(2009)117:137-149)。

11、v.ad和其他疾病中的tdp-43

12、tdp-43病理狀況發(fā)生在多達(dá)57％的患有阿爾茨海默病的患者的腦中(josephskaet?al.,acta?neuropathol.2014；127(6):811-824；josephs?kaet?al.,actaneuropathol.2014；127(3):441–450；mcaleese?et?al.,brain?pathol.2017jul；27(4):472-479)。tdp-43聚集與患者的年齡相關(guān)，并且與ad中認(rèn)知下降、記憶喪失和顳內(nèi)側(cè)萎縮相關(guān)。顯然，在ad中，tdp-43代表與顳葉內(nèi)側(cè)中β淀粉樣蛋白和tau病理共有重疊腦分布的第二或獨立的病理。病理性tdp-43遵循常規(guī)的進(jìn)行性沉積模式，這種模式已通過所謂的ad中tdp-43(tad)分期方案進(jìn)行了描述：tdp-43首先在杏仁核中沉積(i期)，然后在海馬、邊緣、顳并且最終是額葉紋狀體(frontostriatum)(v期)中沉積(josephs?kaet?al.,actaneuropathol.2014；127(6):811-824；josephs?kaet?al.,acta?neuropathol.2014；127(3):441–450)。

13、vi.tdp-43擴(kuò)散

14、盡管als和ftd發(fā)作和初始癥狀在患者間明顯不同，但疾病進(jìn)展的共同特征是病理從最初的病灶區(qū)域向大多數(shù)神經(jīng)元擴(kuò)散。癥狀的持續(xù)惡化可通過tdp-43病理狀況的進(jìn)行性擴(kuò)散來解釋。als患者腦中的tdp-43病理狀況顯示以四階段過程擴(kuò)散并且認(rèn)為使用順行軸突運輸通過離皮質(zhì)軸突透射經(jīng)突觸發(fā)生傳播(brettschneider?et?al.,annneurol.2013july；74(1):20–38.)。最近的實驗證據(jù)支持β淀粉樣蛋白、tau、α-突觸核蛋白和tdp-43通過朊病毒樣機(jī)制在神經(jīng)元組織中進(jìn)行蛋白質(zhì)傳播的假設(shè)(hasegawa?et?al.,2017)，其中起點和地形學(xué)擴(kuò)散模式對于四種蛋白質(zhì)是不同的(brettschneider?j?et?al.,nature?rev.neuroscience,2015,109)。認(rèn)為常見的疾病統(tǒng)一機(jī)制是基于病理性蛋白質(zhì)聚集體的細(xì)胞間擴(kuò)散。該機(jī)制由以下組成：聚集體從病變細(xì)胞釋放，被幼稚細(xì)胞攝取，以及通過內(nèi)源性蛋白質(zhì)的模板化構(gòu)象變化對病理性蛋白質(zhì)構(gòu)象進(jìn)行播種(seed)。能夠誘導(dǎo)生理性(即非病理性tdp-43)聚集的病理性tdp-43被定義為具有播種能力的tdp-43。事實上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)tdp-43錯折疊并聚集成種子(seed)，這些種子是具有引發(fā)從頭錯折疊的能力的繁殖媒介(propagating?agent)。這種“類朊病毒”的范例被懷疑是疾病發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。

15、tdp-43細(xì)胞間擴(kuò)散已在分子水平上在少數(shù)體外模型中進(jìn)行了研究，其中來自患者腦的不溶性tdp-43制備物能夠誘導(dǎo)接受體細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)聚集體形成(nonaka?et?al.,cell?reports?4(2013),124–134；feiler?et?al.,2015；porta?et?al.,nat.comm.,2018)。此外，已觀察到細(xì)胞內(nèi)tdp-43聚集體在擴(kuò)散至下一個細(xì)胞之前與外排體聯(lián)合釋放(nonakaet?al.,cell?reports?4(2013,124–134))。類似地，腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的tdp-43表達(dá)導(dǎo)致磷酸化、泛素化且更重要地充當(dāng)啟動細(xì)胞間擴(kuò)散的種子的細(xì)胞質(zhì)聚集體(ishii?et?al.,plos?one12(6):e0179375,2017)?；颊邅碓吹牟±硇詔dp-43在顱內(nèi)接種到轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠之后可導(dǎo)致內(nèi)源性tdp-43廣泛沉積(porta?et?al.,nat.comm.,2018)。

16、vii.tdp-43蛋白質(zhì)病的預(yù)防和治療

17、tdp-43聚集和病理擴(kuò)散是als和ftd-目前不可治愈的致命性疾病的主要標(biāo)志。因此，需要新的方法來治療和預(yù)防tdp-43蛋白質(zhì)病。tdp-43中的突變與als和ftd的家族性病例相關(guān)，提供了tdp-43錯折疊與疾病進(jìn)展之間的因果聯(lián)系。

18、viii.tdp-43蛋白質(zhì)病的診斷

19、基于臨床表現(xiàn)的ftd診斷是不充分的，因為臨床表現(xiàn)可與其他疾病重疊，特別是在早期階段。

20、許多方法旨在開發(fā)生物化學(xué)生物標(biāo)志物來區(qū)分不同類型的ftd病理。針對tdp-43不同構(gòu)象的抗體的開發(fā)可允許產(chǎn)生更加靈敏且特異性的診斷工具。與生物化學(xué)生物標(biāo)志物并行，成像生物標(biāo)志物的開發(fā)能夠?qū)崿F(xiàn)tdp-43蛋白質(zhì)病中病理的早期且特異性檢測。對腦中tdp-43沉積成像的能力可為tdp-43蛋白質(zhì)病的診斷和藥物開發(fā)的重大成就。使用細(xì)胞可滲透的抗體片段可實現(xiàn)這樣的檢測。

21、基于不同蛋白質(zhì)的錯折疊的神經(jīng)退行性疾病中最早的事件是獲得使蛋白質(zhì)有毒的替代構(gòu)象。此外，這種錯折疊的構(gòu)象可通過將內(nèi)源性正常蛋白質(zhì)募集到錯折疊的構(gòu)象中而自傳播，作為觀察到的通過受影響組織擴(kuò)散的機(jī)制基礎(chǔ)。

22、為了開發(fā)針對給定蛋白質(zhì)的不同構(gòu)象狀態(tài)的抗體，設(shè)計了超分子抗原性構(gòu)建體，其中控制所呈遞抗原的構(gòu)象以產(chǎn)生針對特定構(gòu)象狀態(tài)下給定靶標(biāo)的構(gòu)象特異性抗體(wo2012/055933和wo2012/020124)。構(gòu)象特異性抗體提供許多優(yōu)勢，因為其可區(qū)分這些蛋白質(zhì)的疾病相關(guān)構(gòu)象與功能性內(nèi)源性構(gòu)象。該方法在治療應(yīng)用中提供了許多優(yōu)勢，因為這樣的抗體在靶向蛋白質(zhì)的錯折疊疾病相關(guān)異形體的同時不太可能被其正常構(gòu)象吸引。與此類似，在診斷應(yīng)用中，這樣的抗體僅識別蛋白質(zhì)的疾病相關(guān)結(jié)構(gòu)狀態(tài)，這對于靈敏且特異性的診斷的開發(fā)至關(guān)重要。

23、基于tdp-43的生物標(biāo)志物在tdp-43蛋白質(zhì)病中的應(yīng)用仍有待建立。這樣的評價受到阻礙，部分是由于缺乏可用于合適免疫測定中用來對生物流體中病理性tdp-43進(jìn)行定量的高親和力抗體(feneberg?et?al.,molecular?neurobiology,2018)。

24、因此，明確需要能夠檢測，特別是在人樣品中檢測錯折疊的聚集tdp-43和非聚集生理性tdp-43的生物標(biāo)志物，用于診斷不同類型的tdp-43蛋白質(zhì)病和/或用于監(jiān)測用于治療與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病的治療藥物的效力。

25、tdp-43蛋白質(zhì)病定義為一組以病理性tdp-43為特征的神經(jīng)退行性疾病。

26、ix.現(xiàn)有技術(shù)

27、專利申請wo2008/151055公開了使用生物流體中tdp-43多肽和/或tdp-43多肽切割產(chǎn)物(例如25kd和35kd?tdp-43多肽切割產(chǎn)物)的水平來確定哺乳動物是否患有神經(jīng)退行性疾病的方法和材料。

28、專利申請wo2013/061163公開了tdp-43特異性結(jié)合分子，其包括多肽例如人抗體及其片段、衍生物和變體。

29、專利申請wo2020/234473公開了特異性結(jié)合分子，包括多肽，例如鼠抗體或其抗原結(jié)合片段。

30、給藥方案是藥物目標(biāo)產(chǎn)品特性的關(guān)鍵要素之一。由于生物制劑的次優(yōu)腦滲透，目前只有在重復(fù)施用抗體之后才能達(dá)到藥物暴露。為了確?？贵w的期望藥理作用所需的有效藥物分布，合適的藥代動力學(xué)譜對于其體內(nèi)治療應(yīng)用至關(guān)重要。對于一些抗體，優(yōu)化藥代動力學(xué)參數(shù)，例如清除率和/或分布體積，可以使體內(nèi)的藥物暴露最大化。

31、抗體通過其fc結(jié)構(gòu)域與新生fc受體(fcrn)的相互作用而再循環(huán)。通過蛋白質(zhì)工程可以提高對fcrn的親和力，將其并轉(zhuǎn)化為改善的再循環(huán)譜和更長的抗體半衰期。已經(jīng)描述了數(shù)個突變組，例如yte(dall’acqua?et?al.journal?of?immunology,2002,69:5171-5180)或ls(zalevsky,j?et?al,nat?biotechnol?28(2):157-9,2010)突變，其導(dǎo)致體內(nèi)藥代動力學(xué)譜的改善。在一些情況下，高pi和正電荷斑塊已顯示出對抗體清除有負(fù)面影響(igawa?et?al,peds.2010；vol.23no.5pp.385–392,bumbaca?et?al,jbc,vol.290,no.50,pp.29732–29741,2015)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、由于目前市場上沒有tdp-43抗體治療，因此需要具有用于體內(nèi)治療應(yīng)用的適合的藥代動力學(xué)參數(shù)的抗tdp-43抗體。不希望受任何特定理論的束縛，認(rèn)為本發(fā)明的結(jié)合分子，特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，包含人源化受體框架，其導(dǎo)致用于體內(nèi)治療應(yīng)用的最佳半衰期。本文顯示本發(fā)明的結(jié)合分子(尤其是haci-7069-633b12-ab1_h33l27和haci-7069-633b12-ab1_h32l27)提供了有益的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)特性。參見本文的實施例5-14以及表9、10和11。本發(fā)明的結(jié)合分子顯示出用于治療用途的合適的半衰期和清除值。

2、存在對結(jié)合錯折疊的聚集tdp-43和非聚集的生理性tdp-43、具有用于體內(nèi)治療應(yīng)用的適合的藥代動力學(xué)參數(shù)的人源化抗tdp-43結(jié)合分子的需求。這樣的人源化結(jié)合分子、特別是抗體及其抗原結(jié)合片段可與人tdp-43(seq?id?no:1)的特定表位結(jié)合。此外，開發(fā)可區(qū)分ftd譜內(nèi)病理狀況類型的敏感和特異性生物標(biāo)志物是一項緊迫的任務(wù)。

3、本文中提供的一些實施方案解決了該技術(shù)問題。

4、本發(fā)明的結(jié)合分子是鼠抗體的人源化形式，特別地，它們是與人tdp-43(seq?idno:1)結(jié)合的鼠單克隆抗體的人源化形式。選擇本文中稱為aci-7069-633b12-ab1的抗體來開發(fā)人源化結(jié)合分子。如本文中所述，該抗體源自雜交瘤克隆633b12c8。它與人tdp-43(seqid?no:1)的第397至411位氨基酸內(nèi)的表位結(jié)合。更特別地，它與來自人tdp-43(seq?id?no:1)的第400至405位氨基酸的表位結(jié)合。該抗體具有seq?id?no:28中所示的vh核苷酸序列和seq?id?no:29中所示的vl核苷酸序列(由其編碼)，參見wo2020/234473的表10。該抗體具有seq?id?no:20中所示的vh氨基酸序列和seq?id?no:24中所示的vl氨基酸序列，參見wo2020/234473的表11。該抗體具有seq?id?no:21中所示的vh?cdr1氨基酸序列、seq?idno:22中所示的vh?cdr2氨基酸序列和es的vh?cdr3氨基酸序列，參見wo2020/234473的表11。該抗體具有seq?id?no:25中所示的vlcdr1氨基酸序列、seq?id?no:16中所示的vl?cdr2氨基酸序列和seq?id?no:27中所示的vl?cdr3氨基酸序列，參見wo2020/234473的表11。

5、所選擇的cdr序列可在特定位置處發(fā)生突變。在一些實施方案中，進(jìn)行這樣的突變以避免潛在的翻譯后修飾位點。在一些具體的實施方案中，以下殘基中的一個或更多個、直至所有在vh區(qū)(cdrh2)中發(fā)生突變：n53、n54和g55。一些具體突變包括：n53g、n53s、n53q、n54q、n54g和g55a。殘基根據(jù)kabat進(jìn)行編號。在一些具體的實施方案中，以下殘基中的一個或更多個、直至所有在vl區(qū)(cdrl1和/或cdrl2和/或cdrl3)中發(fā)生突變：k24、d28、g29、d55、s56和w89。殘基根據(jù)kabat進(jìn)行編號。一些具體突變包括：k24r、d28e、d28g、g29a、d55e、s56a、w89y、w89f和w89l。

6、在一些具體的實施方案中，本發(fā)明的人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含人重鏈可變結(jié)構(gòu)域亞家族1框架序列。更特別地，本發(fā)明的人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可包含ighv1-69-2(imgt登錄號kf698734、z29977、z12305；uniprotkb?a0a0g2jmi3)、ighv1-3(imgt登錄號x62109、x62107、mk540645、mh779622和mn337616；uniprotkb-a0a0c4dh29)、ighv1-2(imgt登錄號x07448、x62106、x92208、kf698733、hm855674、mh267285和mn337615；uniprotkb-p23083)、ighv1-46(imgt登錄號x92343、j00240、l06612和mk540650；uniprotkb-p01743)、ighv1-24(imgt登錄號m99642；uniprotkb-a0a0c4dh33)、ighv5-51(imgt登錄號m99686、m18806、x56368、x56367、z27449、mk321694、imgt000055；uniprotkb?a0a0c4dh38)或ighv3-43(imgt登錄號m99672、hm855392；uniprotkb?a0a0b4j1x8)vh框架序列，優(yōu)選ighv1-69-2vh框架序列。

7、在一些具體的實施方案中，本發(fā)明的人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域κ亞家族2框架序列。更特別地，本發(fā)明的人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可包含igkv2-30(imgt登錄號x63403和fm164408；uniprotkb-p06310)、igkv2-29(imgt登錄號x63396、u41645和aj783437；uniprotkb-a2njv5)、igkv2d-29(imgt登錄號m31952和u41644；uniprotkb-a0a075b6s2)、igkv2-28(imgt登錄號x63397；uniprotkb-a0a075b6p5)、igkv2-24(imgt登錄號x12684；uniprotkb-a0a0c4dh68)、igkv2d-28(imgt登錄號x12691；uniprotkb-p01615)、igkv2-40(imgt登錄號x59314和x59317；uniprotkb-a0a087ww87)、igkv2d-40(imgt登錄號x59311；uniprotkb-p01614)或igkv4-1(imgt登錄號z00023和mw316673；uniprotkb-p06312)vl框架序列，優(yōu)選igkv2-40、igkv2d-40、igkv2d-28、igkv4-1或igkv2-28?vl框架序列，最優(yōu)選igkv2-28(imgt登錄號x63397；uniprotkb-a0a075b6p5)vl框架序列。

8、在一個實施方案中，本發(fā)明的人源化結(jié)合分子，特別是本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含ighv1-69-2和igkv2-28框架序列。

9、所選擇的框架序列可在特定位置處發(fā)生突變。在一些實施方案中，進(jìn)行這樣的突變以積極影響cdr環(huán)構(gòu)象和/或vh和vl結(jié)構(gòu)域之間的可變結(jié)構(gòu)域堆積(packing)。在某些實施方案中，下表2中所列的根據(jù)kabat編號的殘基中的一個或更多個、直至所有發(fā)生突變。在一些具體的實施方案中，進(jìn)行了根據(jù)kabat編號的以下vh突變中的一個或更多個、直至所有：v24t、y27f、m48i、q64k、a71v、t73k、t94r。在一些具體實施方案中，進(jìn)行了以下vl突變(根據(jù)kabat編號)中的一個或更多個、直至所有：i2v、y36l、q45k、l46r、g57r。在一些具體的實施方案中，進(jìn)行了以下vh突變中的一個或更多個、直至所有：v24t、y27f、m48i、q64k、a71v、t73k、t94r，以及以下vl突變中的一個或更多個、直至所有：i2v、y36l、q45k、l46r、g57r，所有都根據(jù)kabat編號。

10、因此，本發(fā)明涉及特異性識別錯折疊的聚集tdp-43和非聚集生理性tdp-43的人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。在本發(fā)明中，錯折疊的tdp-43包括錯折疊的單體tdp-43和/或錯折疊的寡聚tdp-43和/或錯折疊的聚集和/或經(jīng)翻譯后修飾的tdp-43和/或錯折疊的截短tdp-43。經(jīng)翻譯后修飾的tdp-43包含磷酸化、泛素化、乙?；?、類泛素化和/或甲基化的tdp-43。生理性tdp-43包括可溶性細(xì)胞核tdp-43。本文中表明，本發(fā)明的人源化結(jié)合分子能夠結(jié)合病理性tdp-43，包括tdp-43聚集體和磷酸化tdp-43。因此，本發(fā)明提供了特異性識別錯折疊的聚集tdp-43和非聚集生理性tdp-43的人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。這樣的結(jié)合分子在本文中稱為人源化“泛-tdp-43”結(jié)合分子、特別是人源化泛-tdp-43抗體。如本文中說明的，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子可同等地結(jié)合錯折疊的聚集tdp-43和非聚集生理性tdp-43，或者在與兩種類型的tdp-43特異性結(jié)合時相對于一者優(yōu)先與另一者結(jié)合。本發(fā)明還提供了用于預(yù)防、減輕、治療和/或診斷與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病的人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還提供了用于檢測和/或了解(即鑒定)引起神經(jīng)變性的特定病理類型的人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。設(shè)想了用作診斷性生物標(biāo)志物，實現(xiàn)臨床研究中縱向監(jiān)測的更有效且精確的對象選擇，支持tdp-43蛋白質(zhì)病的新治療的開發(fā)的用途。

11、本發(fā)明還提供了作為藥物(治療劑)的人源化tdp-43結(jié)合分子、特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。

12、不希望受理論束縛，本發(fā)明是基于以下假設(shè)而開發(fā)的：來源于tdp-43蛋白的經(jīng)修飾構(gòu)象特異性抗原性肽和肽片段或整個tdp-43蛋白以及可通過或通過使用所述肽或片段或整個tdp-43蛋白作為抗原而獲得的人源化抗體阻斷tdp-43細(xì)胞間傳播，和/或使tdp-43聚集體解聚和/或阻斷tdp-43播種和/或中和具有播種能力的tdp-43和/或抑制tdp-43蛋白或其片段的聚集和/或增強(qiáng)tdp-43清除。本發(fā)明的人源化結(jié)合分子、特別是人源化多肽、更特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，與錯折疊的聚集tdp-43，特別是與細(xì)胞質(zhì)錯折疊tdp-43和胞外錯折疊tdp-43結(jié)合。本發(fā)明的人源化結(jié)合分子、特別是人源化多肽、更特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，與全長tdp-43和/或截短的tdp-43結(jié)合。在一個實施方案中，本發(fā)明的人源化結(jié)合分子、特別是人源化多肽、更特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，與細(xì)胞質(zhì)錯折疊tdp-43特異性結(jié)合。在一個實施方案中，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，結(jié)合并中和具有播種能力的tdp-43。在一個實施方案中，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，結(jié)合胞外和/或聚集的tdp-43，并通過抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(adcp)增強(qiáng)免疫細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞對其的清除。

13、錯折疊的聚集tdp-43或病理相關(guān)tdp-43由失去其正常折疊(即是錯折疊的)和定位的tdp-43蛋白構(gòu)成。錯折疊的聚集tdp-43可在以下中發(fā)現(xiàn)：前包涵體(preinclusion)，以及神經(jīng)元胞質(zhì)包涵體和膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)包涵體(分別為nci和gci)、神經(jīng)元核內(nèi)包涵體(nii)和營養(yǎng)不良性神經(jīng)突(dn)，其對tdp-43具有免疫反應(yīng)性。

14、非聚集生理性tdp-43是主要位于細(xì)胞核并穿梭至細(xì)胞質(zhì)，處于能夠在體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境中展示其期望功能的狀態(tài)的生理功能性tdp-43蛋白。

15、本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子、特別是人源化抗tdp-43抗體或其抗原結(jié)合片段，出乎意料地具有以下特征中的至少一個，優(yōu)選兩個，更優(yōu)選三個，甚至更優(yōu)選四個，還更優(yōu)選五個，還甚至更優(yōu)選六個，最優(yōu)選全部七個：

16、-阻斷tdp-43細(xì)胞間傳播；

17、-使tdp-43聚集體解聚；

18、-抑制tdp-43蛋白或其片段的聚集；

19、-阻斷tdp-43播種；

20、-中和具有播種能力的tdp-43；

21、-阻斷tdp-43擴(kuò)散；以及

22、-增強(qiáng)tdp-43清除。

23、獨立于一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個上述列舉特征的組合，本發(fā)明的人源化抗tdp-43結(jié)合分子，優(yōu)選人源化抗tdp-43抗體或其抗原結(jié)合片段，可改善/抑制/降低tdp-43蛋白質(zhì)病體內(nèi)模型中并且更重要地患有tdp-43病理狀況的患者中tdp-43病理狀況的形成。

24、人源化抗tdp-43結(jié)合分子與人tdp-43(seq?id?no:1)的第397至411位氨基酸內(nèi)的區(qū)域結(jié)合，更特別地，人源化tdp-43結(jié)合分子與人tdp-43(seq?id?no:1)第400至405位氨基酸殘基內(nèi)的表位結(jié)合。

25、根據(jù)本發(fā)明，提供了人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化tdp-43抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含：

26、a.vh-cdr1，其包含seq?id?no:21的氨基酸序列；

27、b.vh-cdr2，其選自seq?id?no:22、seq?id?no:82、seq?id?no:92、seq?id?no:102、seq?id?no:112或seq?id?no:122的氨基酸序列；

28、c.vh-cdr3，其包含氨基酸序列es(glu-ser)；

29、d.vl-cdr1，其選自seq?id?no:25或seq?id?no:85的氨基酸序列；

30、e.vl-cdr2，其選自seq?id?no:16的氨基酸序列；

31、f.vl-cdr3，其選自seq?id?no:27或seq?id?no:87的氨基酸序列；和

32、g.重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)的受體框架，其選自ighv1-69-2、ighv5-51或ighv3-43，優(yōu)選ighv1-69-2；和/或者

33、h.輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的受體框架，其選自igkv2-28、igkv2-24、igkv2d-28、igkv2-40、igkv2d-40或igkv4-1，優(yōu)選igkv2-28。

34、在一些優(yōu)選的實施方案中，人源化tdp-43結(jié)合分子：包含vh的受體框架，所述vh的受體框架包含以下vh突變中的一個或更多個、以及優(yōu)選所有：

35、a.v24t；

36、b.m48i；

37、c.a71v；

38、d.t73k；和

39、e.t94r；和/或者包含vl的受體框架，所述vl的受體框架包含以下vl突變中的一個或更多個：

40、f.i2v；

41、g.y36l；

42、h.q45k；

43、i.l46r；和

44、j.g57r(根據(jù)kabat編號)。

45、在一些優(yōu)選的實施方案中，人源化tdp-43結(jié)合分子：包含vh的受體框架，所述vh的受體框架包含以下vh突變中的一個或更多個、以及優(yōu)選所有：

46、a.v24t；

47、b.y27f

48、c.m48i；

49、d.a71v；

50、e.t73k；和

51、f.t94r；和/或者包含vl的受體框架，所述vl的受體框架包含以下vl突變中的一個或更多個：

52、g.i2v；

53、h.y36l；

54、i.q45k；

55、j.l46r；和

56、k.g57r(根據(jù)kabat編號)。

57、在一些更優(yōu)選的實施方案中，人源化tdp-43結(jié)合分子：包含vh的受體框架，所述vh的受體框架包含所有以下vh突變：

58、a.v24t；

59、b.m48i；

60、c.a71v；

61、d.t73k；和

62、e.t94r；和/或者包含vl的受體框架，所述vl的受體框架包含以下vl突變中的一個或更多個、優(yōu)選全部：

63、f.y36l；

64、g.l46r；和

65、h.g57r(根據(jù)kabat編號)。

66、在一些更優(yōu)選的實施方案中，人源化tdp-43結(jié)合分子：包含vh的受體框架，所述vh的受體框架包含所有以下vh突變：

67、a.v24t；

68、b.y27f

69、c.m48i；

70、d.a71v；

71、e.t73k；和

72、f.t94r；和/或者包含vl的受體框架，所述vl的受體框架包含以下vl突變中的一個或更多個、優(yōu)選全部：

73、i.y36l；

74、j.l46r；和

75、k.g57r(根據(jù)kabat編號)。

76、在一個優(yōu)選的實施方案中，人源化tdp-43結(jié)合分子：包含vh的受體框架，所述vh的受體框架包含所有以下vh突變：

77、a.v24t；

78、b.m48i；

79、c.a71v；

80、d.t73k；和

81、e.t94r；以及包含vl的受體框架，所述vl的受體框架包含以下vl突變中的一個或更多個、優(yōu)選全部：

82、f.y36l；

83、g.l46r；和

84、h.g57r(根據(jù)kabat編號)。

85、在一個優(yōu)選的實施方案中，人源化tdp-43結(jié)合分子：包含vh的受體框架，所述vh的受體框架包含所有以下vh突變：

86、a.v24t；

87、b.y27f

88、c.m48i；

89、d.a71v；

90、e.t73k；和

91、f.t94r；以及包含vl的受體框架，所述vl的受體框架包含所有以下vl突變：

92、i.y36l；

93、j.l46r；和

94、k.g57r(根據(jù)kabat編號)。

95、人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化tdp-43抗體或其抗原結(jié)合片段，可以包含：

96、a.vh-cdr1，其包含seq?id?no:21的氨基酸序列；

97、b.vh-cdr2，其選自seq?id?no:112、seq?id?no:122或seq?id?no:102的氨基酸序列；

98、c.vh-cdr3，其包含氨基酸序列es(glu-ser)；

99、d.vl-cdr1，其選自seq?id?no:25或seq?id?no:85的氨基酸序列；

100、e.vl-cdr2，其選自seq?id?no:16的氨基酸序列；和

101、f.vl-cdr3，其選自seq?id?no:27或seq?id?no:87的氨基酸序列。

102、在一些優(yōu)選的實施方案中，人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化tdp-43抗體或其抗原結(jié)合片段，包含：

103、a.vh-cdr1，其包含seq?id?no:21的氨基酸序列；

104、b.vh-cdr2，其選自seq?id?no:112或seq?id?no:122的氨基酸序列；

105、c.vh-cdr3，其包含氨基酸序列es(glu-ser)；

106、d.vl-cdr1，其選自seq?id?no:25或seq?id?no:85的氨基酸序列；

107、e.vl-cdr2，其選自seq?id?no:16的氨基酸序列；和

108、f.vl-cdr3，其選自seq?id?no:27或seq?id?no:87的氨基酸序列。

109、在一些實施方案中，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子包含：

110、-包含seq?id?no:21的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq?id?no:22的氨基酸序列的vh-cdr2和包含氨基酸序列es(glu-ser)的vh-cdr3；以及包含seq?id?no:25的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seq?id?no:16的氨基酸序列的vl-cdr2和包含seq?id?no:27的氨基酸序列的vl-cdr3；或者

111、-包含seq?id?no:21的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq?id?no:112的氨基酸序列的vh-cdr2和包含氨基酸序列es(glu-ser)的vh-cdr3；以及包含seq?id?no:25的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seq?id?no:16的氨基酸序列的vl-cdr2和包含seq?id?no:27的氨基酸序列的vl-cdr3；

112、-包含seq?id?no:21的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq?id?no:112的氨基酸序列的vh-cdr2和包含氨基酸序列es(glu-ser)的vh-cdr3；以及包含seq?id?no:85的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seq?id?no:16的氨基酸序列的vl-cdr2和包含seq?id?no:87的氨基酸序列的vl-cdr3；

113、-包含seq?id?no:21的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq?id?no:122的氨基酸序列的vh-cdr2和包含氨基酸序列es(glu-ser)的vh-cdr3；以及包含seq?id?no:25的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seq?id?no:16的氨基酸序列的vl-cdr2和包含seq?id?no:27的氨基酸序列的vl-cdr3；

114、-包含seq?id?no:21的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq?id?no:122的氨基酸序列的vh-cdr2和包含氨基酸序列es(glu-ser)的vh-cdr3；以及包含seq?id?no:85的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seq?id?no:16的氨基酸序列的vl-cdr2和包含seq?id?no:87的氨基酸序列的vl-cdr3；

115、-包含seq?id?no:21的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq?id?no:112的氨基酸序列的vh-cdr2和包含氨基酸序列es(glu-ser)的vh-cdr3；以及包含seq?id?no:25的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seq?id?no:16的氨基酸序列的vl-cdr2和包含seq?id?no:87的氨基酸序列的vl-cdr3；

116、-包含seq?id?no:21的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seq?id?no:122的氨基酸序列的vh-cdr2和包含氨基酸序列es(glu-ser)的vh-cdr3；以及包含seq?id?no:25的氨基酸序列的vl-cdr1、包含seq?id?no:16的氨基酸序列的vl-cdr2和包含seq?id?no:87的氨基酸序列的vl-cdr3。

117、本發(fā)明尤其另外涉及：(i)包含人源化tdp-43結(jié)合分子的免疫綴合物，(ii)包含人源化tdp-43結(jié)合分子的經(jīng)標(biāo)記抗體，(iii)包含人源化tdp-43結(jié)合分子和可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑的藥物組合物，(iv)人源化tdp-43結(jié)合分子，其用于人用或獸用藥物用途，(v)人源化tdp-43結(jié)合分子，其用于預(yù)防、減輕、治療與tdp-43相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病，(vi)人源化tdp-43結(jié)合分子，其用于診斷用途(特別是用于體內(nèi)診斷，但也用于體外測試)，(vii)人源化tdp-43結(jié)合分子，其用于研究用途，特別是作為分析工具或參考分子，(viii)人源化tdp-43結(jié)合分子，其用作監(jiān)測與tdp-43相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病的診斷工具，(ix)通過用人源化tdp-43結(jié)合分子治療患有與tdp-43相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病的個體來在所述個體中保持或提高認(rèn)知記憶能力或減緩記憶喪失的方法，(x)通過用人源化tdp-43結(jié)合分子治療所述個體來降低個體中聚集tdp-43和/或磷酸化tdp-43水平的方法，(xi)編碼人源化tdp-43結(jié)合分子的核酸分子，(xii)包含本發(fā)明核酸分子的重組表達(dá)載體，(xiii)包含本發(fā)明核酸和/或載體的宿主細(xì)胞，(xiv)包含本發(fā)明重組表達(dá)載體的無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，(xv)用于產(chǎn)生人源化tdp-43結(jié)合分子的方法，(xvi)使用人源化tdp-43結(jié)合分子對從對象獲得的樣品中的tdp-43進(jìn)行定量的方法，以及(xvii)包含本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子和/或核酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和/或用于產(chǎn)生它們的無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒。

118、本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子、特別是人源化抗tdp-43抗體或其抗原結(jié)合片段，可募集和/或激活小膠質(zhì)細(xì)胞。更特別地，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子可在細(xì)胞尺寸和活化狀態(tài)方面影響小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。這可有助于由本發(fā)明的tdp-43結(jié)合分子表明的tdp-43病理狀況降低。

119、在本發(fā)明中，人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，特異性識別tdp-43。本發(fā)明的人源化結(jié)合分子包括對tdp-43蛋白具有特異性的人源化多肽和/或人源化抗體和/或其抗原結(jié)合片段?！疤禺愋宰R別tdp-43”意指，與其他表位相比，本發(fā)明的人源化結(jié)合分子特異性地、一般地且共同地以更大的親和力與tdp-43，特別是tdp-43中的一些表位，特別是tdp-43蛋白的以一種或更多種病理性構(gòu)象暴露/可及的表位結(jié)合。本發(fā)明的與tdp-43特異性結(jié)合的人源化結(jié)合分子、特別是人源化多肽，更特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，特異性識別錯折疊的聚集tdp-43和非聚集生理性tdp-43。

120、本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，與非聚集生理性tdp-43和聚集tdp-43二者結(jié)合。因此，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，可與可溶性tdp-43和聚集tdp-43大致同等良好地結(jié)合。本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，與非聚集tdp-43相比，可與聚集tdp-43大致同等地結(jié)合。更具體地，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，與細(xì)胞核中的非聚集tdp-43相比，可與細(xì)胞質(zhì)中的聚集tdp-43大致同等地結(jié)合。在另一些實施方案中，當(dāng)與兩種類型的tdp-43結(jié)合時，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，與非聚集tdp-43相比，可優(yōu)先與聚集tdp-43結(jié)合。更具體地，當(dāng)與兩種類型的tdp-43結(jié)合時，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，與細(xì)胞核中的非聚集tdp-43相比，可優(yōu)先與細(xì)胞質(zhì)中的聚集tdp-43結(jié)合?；蛘撸诹硪恍嵤┓桨钢?，當(dāng)與兩種類型的tdp-43結(jié)合時，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，與聚集tdp-43相比，可優(yōu)先與非聚集tdp-43結(jié)合。更特別地，當(dāng)與兩種類型的tdp-43結(jié)合時，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，與細(xì)胞質(zhì)中聚集tdp-43相比，可優(yōu)先與細(xì)胞核中的非聚集tdp-43結(jié)合。這些結(jié)合特性可例如使用免疫組織化學(xué)來證明。

121、在一些實施方案中，本發(fā)明涵蓋特異性結(jié)合tdp-43的本文中所述的本發(fā)明的人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體及其抗原結(jié)合片段，以及這些人源化結(jié)合分子診斷、預(yù)防、減輕和/或治療與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病的用途，所述疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病包括但不限于：額顳癡呆(ftd)、肌萎縮側(cè)索硬化(als)、阿爾茨海默病(ad)、帕金森病(pd)、慢性創(chuàng)傷性腦病(cte)和邊緣主導(dǎo)年齡相關(guān)性tdp-43腦病(late)。本文中公開的方法和組合物可應(yīng)用于診斷、預(yù)防、減輕和/或治療與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病，包括但不限于額顳癡呆(ftd)、肌萎縮側(cè)索硬化(als)。優(yōu)選地，這些人源化結(jié)合分子診斷、預(yù)防、減輕和/或治療與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病的用途針對肌萎縮側(cè)索硬化(als)、阿爾茨海默病(ad)或額顳癡呆(ftd)。更優(yōu)選地，該用途針對肌萎縮側(cè)索硬化(als)。更優(yōu)選地，該用途針對阿爾茨海默病(ad)。更優(yōu)選地，該用途針對額顳癡呆(ftd)。

122、在另一個實施方案中，使對tdp-43具有特異性的本文中所述的本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子、特別是人源化抗tdp-43抗體或其抗原結(jié)合片段與樣品接觸以檢測、診斷和/或監(jiān)測與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病，其選自額顳癡呆(ftd，例如散發(fā)性或家族性、伴有或不伴有運動神經(jīng)元病(mnd)、有顆粒蛋白前體(grn)突變、有c9orf72突變、有tardbp突變、有含纈酪肽蛋白(vcp)突變、與9p染色體連鎖、皮質(zhì)基底節(jié)變性、有泛素陽性tdp-43包涵體的額顳葉變性(ftld)(ftld-tdp)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發(fā)性進(jìn)行性失語(svppa)、行為變異型ftd(bvftd)、非流利性變異型原發(fā)性進(jìn)行性失語(nfvppa)，等)、肌萎縮側(cè)索硬化(als，例如散發(fā)性als、有tardbp突變、有血管生成蛋白(ang)突變)、亞歷山大病(axd)、邊緣主導(dǎo)年齡相關(guān)性tdp-43腦病(late)、慢性創(chuàng)傷性腦病(cte)、佩里綜合征、阿爾茨海默病(ad，包括散發(fā)性和家族性形式的ad)、唐氏綜合征、家族性英國型癡呆、多聚谷氨酰胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型(sca3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發(fā)性包涵體肌炎、包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白((vcp)突變；以及佩吉特骨病和額顳癡呆)、有鑲邊空泡的眼咽肌營養(yǎng)不良、有肌收縮蛋白(myot)基因突變或編碼結(jié)蛋白(des)之基因的突變的肌原纖維肌病、創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)、路易體癡呆(dlb)或帕金森病(pd)。

123、在一個實施方案中，本發(fā)明涵蓋特異性結(jié)合tdp-43的本文中所述的本發(fā)明的人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，以及這些人源化結(jié)合分子，特別是這些人源化抗體檢測樣品中tdp-43的存在的用途。因此，本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，例如本文中所述的人源化抗tdp43抗體可特別用于針對樣品中tdp-43的存在篩選臨床樣品，特別是人血液、腦脊液(csf)、組織間液(interstitial?fluid，isf)和/或尿，例如，通過使用基于elisa的測定或表面適應(yīng)測定進(jìn)行。在一些情況下，可使用組織樣品，例如腦組織樣品。本發(fā)明的方法和組合物還可應(yīng)用于診斷癥狀前疾病和/或監(jiān)測疾病進(jìn)展和/或治療效力。根據(jù)一些實施方案，使對tdp-43具有特異性的人源化抗體(例如，全長人源化抗體或人源化抗體的tdp-43結(jié)合片段或衍生物)與樣品(例如，血液、尿液、腦脊液(csf)、組織間液(isf)或腦組織)接觸以檢測、診斷和/或監(jiān)測額顳癡呆(ftd，例如散發(fā)性或家族性、伴有或不伴有運動神經(jīng)元病(mnd)、有顆粒蛋白前體(grn)突變、有c9orf72突變、有tardbp突變、有含纈酪肽蛋白(vcp)突變、與9p染色體連鎖、皮質(zhì)基底節(jié)變性、有泛素陽性tdp-43包涵體的額顳葉變性(ftld)(ftld-tdp)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發(fā)性進(jìn)行性失語(svppa)、行為變異型ftd(bvftd)、非流利性變異型原發(fā)性進(jìn)行性失語(nfvppa)，等)、肌萎縮側(cè)索硬化(als，例如散發(fā)性als、有tardbp突變、有血管生成蛋白(ang)突變)、亞歷山大病(axd)、邊緣主導(dǎo)年齡相關(guān)性tdp-43腦病(late)、慢性創(chuàng)傷性腦病(cte)、佩里綜合征、阿爾茨海默病(ad，包括散發(fā)性和家族性形式的ad)、唐氏綜合征、家族性英國型癡呆、多聚谷氨酰胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型(sca3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發(fā)性包涵體肌炎、包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(vcp)突變；以及佩吉特骨病和額顳癡呆)、有鑲邊空泡的眼咽肌營養(yǎng)不良、有肌收縮蛋白(myot)基因突變或編碼結(jié)蛋白(des)之基因的突變的肌原纖維肌病、創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)、路易體癡呆(dlb)或帕金森病(pd)。本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子可用于對合適樣品，特別是臨床樣品，例如血液、腦組織、csf、isf或尿中的tdp-43進(jìn)行定量，其中與合適的對照相比，相對高的tdp-43水平指示患病和/或患有較晚期的疾病。許多合適的免疫測定形式是已知的。因此，可出于診斷目的進(jìn)行該方法(例如elisa、msd(中尺度發(fā)現(xiàn)(meso?scale?discovery))、htrf(均相時間分辨熒光(homogeneous?timeresolved?fluorescence))和alphalisa)，其中高tdp-43水平指示患病。或者，可出于監(jiān)測目的進(jìn)行該方法。隨時間提高的水平可指示疾病進(jìn)展。隨時間降低的水平可指示疾病消退。該方法還可用于監(jiān)測治療，特別是監(jiān)測特定治療的效力。成功的治療可參考治療之后穩(wěn)定或下降的tdp-43水平來測量。在wo2020/234473的實施例12中表明，來自tdp-43蛋白質(zhì)病患者的csf樣品中的tdp-43水平高于取自健康對象(健康對照)的對照樣品中的。對照樣品可以或可以不與受試樣品并行運行。在一些實施方案中，對照水平是在類似或相同的實驗條件下由取自健康對象的一系列對照樣品確定的，并且用作在受試樣品中確定的水平的比較水平。使用本發(fā)明的人源化結(jié)合分子對合適樣品中tdp-43進(jìn)行定量的方法也可用于選擇治療(用于對象的另外的治療)。因此，設(shè)想了個性化治療方法。在治療之前和之后取樣。如果使用該治療的治療導(dǎo)致在治療之后穩(wěn)定或優(yōu)選降低的tdp-43水平，則可為該對象選擇該治療。如果該治療在治療之后不導(dǎo)致穩(wěn)定或優(yōu)選降低的tdp-43水平，則不為對象選擇該治療。該治療可以是用于治療tdp-43蛋白質(zhì)病的任何合適的候選治療劑。在一些優(yōu)選實施方案中，所述治療包含本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子，通常以如本文中所述的藥物組合物的形式。

124、本發(fā)明的人源化tdp-43結(jié)合分子還可用于將疾病分類為特定類型或亞型。因此，提供了用于對與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常進(jìn)行分類或用于對tdp-43蛋白質(zhì)病進(jìn)行分類的方法，其包括：

125、a.進(jìn)行本發(fā)明的方法，其中與合適的對照相比較地對tdp-43的水平進(jìn)行定量；

126、b.任選地鑒定來自對象的樣品中的突變，包括但不限于顆粒蛋白前體(grn)突變、c9orf72突變、tardbp突變、血管生成蛋白(ang)突變、含纈酪肽蛋白(vcp)突變、肌收縮蛋白(myot)基因突變或編碼結(jié)蛋白(des)之基因的突變；以及

127、c.對與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病進(jìn)行分類。

128、類似地，提供了用于對與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常進(jìn)行分類或用于對tdp-43蛋白質(zhì)病進(jìn)行分類的方法，其包括：進(jìn)行本發(fā)明的方法，其中對從患有與tdp-43相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病的對象獲得的樣品中的tdp-43的水平進(jìn)行定量，其中將該水平與取自患有不同類型或亞型的與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病的對象的對照樣品(即，針對目標(biāo)類型或亞型確定一組代表性對照水平)進(jìn)行比較；并基于比較結(jié)果對與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病進(jìn)行分類。因此，分類基于確定受試樣品與一個或更多個對照樣品之間的最接近的匹配。這些方法還可包括鑒定樣品中的突變，包括但不限于顆粒蛋白前體(grn)突變、c9orf72突變、tadbp突變、血管生成蛋白(ang)突變)、含纈酪肽蛋白(vcp)突變、肌收縮蛋白(myot)基因突變或編碼結(jié)蛋白(des)的基因的突變，其中鑒定出的突變也用于對與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病進(jìn)行分類。為免生疑問，對樣品中突變的鑒定可通過任何合適的方法進(jìn)行；例如，基于樣品內(nèi)核酸分子的核酸測序。樣品可與其中測定tdp-43水平的樣品分開和不同，但來自同一對象。

129、在另一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)防、減輕和/或治療與tdp-43相關(guān)、特別是與tdp-43聚集體相關(guān)的疾病、障礙和/或異常、或tdp-43蛋白質(zhì)病的方法。根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的方法包括向?qū)ο笫┯糜行舛鹊谋疚闹兴龅膶dp-43具有特異性的本發(fā)明的人源化結(jié)合分子、特別是人源化抗體(例如，全長抗體或抗體的tdp-43結(jié)合片段或衍生物)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)防、減輕和/或治療tdp-43蛋白質(zhì)病的方法。根據(jù)一些實施方案，施用對tdp-43具有特異性的本文中所述的人源化結(jié)合分子、特別是本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，以治療、減輕和/或預(yù)防額顳變性(ftd)或肌萎縮側(cè)索硬化(als)。在另一個實施方案中，施用對tdp-43具有特異性的本文中所述的人源化結(jié)合分子、特別是本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段以預(yù)防、減輕和/或治療選自以下的神經(jīng)退行性疾?。侯~顳癡呆(ftd)、肌萎縮側(cè)索硬化(als)、阿爾茨海默病(ad，包括散發(fā)性和家族性形式的ad)、帕金森病(pd)、慢性創(chuàng)傷性腦病(cte)、邊緣主導(dǎo)年齡相關(guān)性tdp-43腦病(late)。

130、在另一個實施方案中，施用對tdp-43具有特異性的本文中所述的人源化結(jié)合分子、特別是本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段以預(yù)防、減輕和/或治療選自以下的疾?。侯~顳癡呆(ftd，例如散發(fā)性或家族性、伴有或不伴有運動神經(jīng)元病(mnd)、有顆粒蛋白前體(grn)突變、有c9orf72突變、有tardbp突變、有含纈酪肽蛋白(vcp)突變、與9p染色體連鎖、皮質(zhì)基底節(jié)變性、有泛素陽性tdp-43包涵體的額顳葉變性(ftld)(ftld-tdp)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發(fā)性進(jìn)行性失語(svppa)、行為變異型ftd(bvftd)、非流利性變異型原發(fā)性進(jìn)行性失語(nfvppa)，等)、肌萎縮側(cè)索硬化(als，例如散發(fā)性als、有tardbp突變、有血管生成蛋白(ang)突變)、亞歷山大病(axd)、邊緣主導(dǎo)年齡相關(guān)性tdp-43腦病(late)、慢性創(chuàng)傷性腦病(cte)、佩里綜合征、阿爾茨海默病(ad，包括散發(fā)性和家族性形式的ad)、唐氏綜合征、家族性英國型癡呆、多聚谷氨酰胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型(sca3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發(fā)性包涵體肌炎、包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白((vcp)突變；以及佩吉特骨病和額顳癡呆)、有鑲邊空泡的眼咽肌營養(yǎng)不良、有肌收縮蛋白(myot)基因突變或編碼結(jié)蛋白(des)之基因的突變的肌原纖維肌病、創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)、路易體癡呆(dlb)或帕金森病(pd)。