本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)或生物制藥，更具體地，本發(fā)明涉及一種抗msln納米抗體；還涉及所述納米抗體的制備方法及其在治療疾病中的用途。

背景技術(shù)：

1、間皮素(mesothelin，msln)是一種糖基磷脂酰肌醇(gpi)錨定的細(xì)胞表面糖蛋白，成熟過程中被蛋白酶水解成通過gpi錨定到細(xì)胞膜的c端部分，即為成熟的間皮素，和以溶解的形式釋放出來n末端部分。成熟的間皮素可被多種蛋白酶(金屬蛋白酶adams、基質(zhì)金屬蛋白酶mmps、膽汁酸輔酶a合成酶bacss)水解，脫落的msln游離于血清中。

2、正常生理狀態(tài)下，msln表達(dá)局限于腹膜、心包膜和胸腔膜的間皮細(xì)胞，且表達(dá)量低；但在間皮瘤、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中具有高表達(dá)。msln的異常表達(dá)在腫瘤細(xì)胞增殖、粘附和耐藥性中起重要作用。msln在正常組織中不表達(dá)或者表達(dá)低，但在腫瘤組織中高表達(dá)，使得其成為治療腫瘤的特異性靶點(diǎn)。

3、納米抗體(nanobody)又稱為單域抗體(sdab)，僅由重鏈構(gòu)成，相較于傳統(tǒng)的igg抗體，具有分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性好、穿透性強(qiáng)等特點(diǎn)。

4、開發(fā)新的有效針對(duì)msln的特異性抗體為msln陽(yáng)性腫瘤的治療帶來希望。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、納米抗體

2、在第一方面，本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合msln的納米抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含seq?id?nos:66～70任一項(xiàng)所示的重鏈可變區(qū)(vhh)中含有的cdr1、cdr2以及cdr3；

3、優(yōu)選地，所述cdrs根據(jù)imgt、kabat、abm、chothia、contact或它們的組合的編號(hào)系統(tǒng)定義。在某些實(shí)施方案中，所述的納米抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含如下cdr1、cdr2以及cdr3：

4、(1)按imgt編號(hào)系統(tǒng)定義：

5、(1a)cdr1包含seq?id?no：1所示的序列，cdr2包含seq?id?no：6所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：11所示的序列；

6、(1b)cdr1包含seq?id?no：2所示的序列，cdr2包含seq?id?no：7所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：12所示的序列；

7、(1c)cdr1包含seq?id?no：3所示的序列，cdr2包含seq?id?no：8所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：13所示的序列；

8、(1d)cdr1包含seq?id?no：4所示的序列，cdr2包含seq?id?no：9所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：14所示的序列；

9、或；

10、(1e)cdr1包含seq?id?no：5所示的序列，cdr2包含seq?id?no：10所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：15所示的序列；

11、(2)按kabat編號(hào)系統(tǒng)定義：

12、(2a)cdr1包含seq?id?no：16所示的序列，cdr2包含seq?id?no：21所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：26所示的序列；

13、(2b)cdr1包含seq?id?no：17所示的序列，cdr2包含seq?id?no：22所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：27所示的序列；

14、(2c)cdr1包含seq?id?no：18所示的序列，cdr2包含seq?id?no：23所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：28所示的序列；

15、(2d)cdr1包含seq?id?no：19所示的序列，cdr2包含seq?id?no：24所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：29所示的序列；

16、或；

17、(2e)cdr1包含seq?id?no：20所示的序列，cdr2包含seq?id?no：25所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：30所示的序列；

18、(3)按abm編號(hào)系統(tǒng)定義：

19、(3a)cdr1包含seq?id?no：31所示的序列，cdr2包含seq?id?no：36所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：26所示的序列；

20、(3b)cdr1包含seq?id?no：32所示的序列，cdr2包含seq?id?no：37所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：27所示的序列；

21、(3c)cdr1包含seq?id?no：33所示的序列，cdr2包含seq?id?no：38所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：28所示的序列；

22、(3d)cdr1包含seq?id?no：34所示的序列，cdr2包含seq?id?no：39所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：29所示的序列；

23、或；

24、(3e)cdr1包含seq?id?no：35所示的序列，cdr2包含seq?id?no：40所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：30所示的序列；

25、(4)按chothia編號(hào)系統(tǒng)定義：

26、(4a)cdr1包含seq?id?no：41所示的序列，cdr2包含seq?id?no：46所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：26所示的序列；

27、(4b)cdr1包含seq?id?no：42所示的序列，cdr2包含seq?id?no：47所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：27所示的序列；

28、(4c)cdr1包含seq?id?no：43所示的序列，cdr2包含seq?id?no：48所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：28所示的序列；

29、(4d)cdr1包含seq?id?no：44所示的序列，cdr2包含seq?id?no：49所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：29所示的序列；

30、或；

31、(4e)cdr1包含seq?id?no：45所示的序列，cdr2包含seq?id?no：50所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：30所示的序列；

32、(5)按contact編號(hào)系統(tǒng)定義：

33、(5a)cdr1包含seq?id?no：51所示的序列，cdr2包含seq?id?no：56所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：61所示的序列；

34、(5b)cdr1包含seq?id?no：52所示的序列，cdr2包含seq?id?no：57所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：62所示的序列；

35、(5c)cdr1包含seq?id?no：53所示的序列，cdr2包含seq?id?no：58所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：63所示的序列；

36、(5d)cdr1包含seq?id?no：54所示的序列，cdr2包含seq?id?no：59所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：64所示的序列；

37、或；

38、(5e)cdr1包含seq?id?no：55所示的序列，cdr2包含seq?id?no：60所示的序列，以及cdr3包含seq?id?no：65所示的序列。

39、在某些實(shí)施方案中，所述的納米抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含seq?id?nos：66～70中任一項(xiàng)所示的重鏈可變區(qū)(vhh)；或包含與seq?id?nos：66～70中任一項(xiàng)所示的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列。

40、在某些實(shí)施方案中，所述的納米抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含與seq?id?nos：66～70中任一項(xiàng)所示的序列相比具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的置換、缺失或添加的序列；優(yōu)選地，所述的置換是保守置換。

41、在某些實(shí)施方案中，所述的納米抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述納米抗體或其抗原結(jié)合片段是駝源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。

42、多特異性抗體

43、在第二方面，本發(fā)明提供了一種多特異性抗體，該多特異性抗體包含第一方面所述的納米抗體或其抗原結(jié)合片段，以及其他的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體類似物。

44、在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多特異性抗體為雙特異性抗體或三特異性抗體或四特異性抗體。

45、抗體的制備

46、本發(fā)明的第一方面所述的納米抗體或第二方面所述的多特異性抗體可以用本領(lǐng)域已知的各種方法來制備，例如通過基因工程重組技術(shù)來獲得。例如，通過化學(xué)合成或pcr擴(kuò)增獲得編碼本發(fā)明納米抗體的重鏈可變區(qū)基因的dna分子。將所得dna分子插入表達(dá)載體內(nèi)，然后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。然后，在特定條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，并表達(dá)本發(fā)明的納米抗體或多特異性抗體。本發(fā)明的抗原結(jié)合片段可以通過水解完整的納米抗體分子獲得。

47、在第三方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，其編碼第一方面所述的納米抗體或其抗原結(jié)合片段或第二方面所述的多特異性抗體。

48、在第四方面，本發(fā)明提供了一種載體(例如克隆載體或表達(dá)載體)，其包含編碼第三方面所述的分離的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體是例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體等。

49、在第五方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其包含第三方面所述的分離的核酸分子或第四方面所述的載體。此類宿主細(xì)胞包括但不限于，原核細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，以及真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如小鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等)。

50、綴合物

51、在第六方面，本發(fā)明提供了綴合物，其包含了第一方面所述的納米抗體或其抗原結(jié)合片段、或第二方面所述的多特異性抗體、或第三方面所述的核酸分子、或第四方面所述的載體以及偶聯(lián)部分。

52、在某些實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)部分選自蛋白標(biāo)簽(protein?tag)。這類蛋白標(biāo)簽是本領(lǐng)域熟知的，其實(shí)例包括但不限于his、flag、gst、mbp、ha、myc、gfp或生物素，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知如何根據(jù)期望目的(例如，純化、檢測(cè)或示蹤)選自合適的蛋白標(biāo)簽。

53、在某些實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)部分選自可檢測(cè)的標(biāo)記，例如酶、放射性同位素、熒光染料、發(fā)光物質(zhì)或生物素。本發(fā)明所述的可檢測(cè)的標(biāo)記可以是通過熒光、光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)手段檢測(cè)的任何物質(zhì)。這類標(biāo)記是本領(lǐng)域熟知的，其實(shí)例包括但不限于，酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性同位素(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、熒光染料(例如，異硫氰酸熒光素(fitc)、熒光素、異硫氰酸四甲基羅丹明(tritc)、藻紅蛋白(pe)、德克薩斯紅、羅丹明、量子點(diǎn)或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa?750)、發(fā)光物質(zhì)(例如化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，如吖啶酯類化合物)、磁珠、測(cè)熱標(biāo)記物例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠，等)珠、以及用于結(jié)合上述標(biāo)記物修飾的親和素(例如，鏈霉親和素)的生物素。在某些實(shí)施方案中，此類標(biāo)記能夠適用于免疫學(xué)檢測(cè)(例如，酶聯(lián)免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法等)。在某些實(shí)施方案中，可通過不同長(zhǎng)度的接頭(linker)將如上所述的可檢測(cè)的標(biāo)記連接至本發(fā)明的納米抗體或其抗原結(jié)合片段，以降低潛在的位阻。

54、在某些實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)部分選自核素、核酸、細(xì)胞因子(例如，il-6、il-15、il-12、il-1b、il-23，等)、免疫激動(dòng)劑(例如，tlr激動(dòng)劑)、小分子毒素、具有結(jié)合活性多肽、蛋白、受體、配體，以及其他抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死的活性物質(zhì)。

55、藥物組合物

56、在第七方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其含有本發(fā)明所述的第一方面所述的納米抗體或其抗原結(jié)合片段或其前體藥物(例如probody)、第二方面所述的多特異性抗體、第三方面所述的分離的核酸分子、第四方面所述的載體、第五方面所述的宿主細(xì)胞或第六方面所述的綴合物，以及藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑；

57、在某些實(shí)施方案中，在所述藥物組合物中還包含另外的藥學(xué)活性劑；在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述另外的藥學(xué)活性劑是具有抗腫瘤活性的藥物，例如鉑類藥物、小分子抑制劑等；某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述另外的藥學(xué)活性劑是增強(qiáng)免疫力的藥物，例如干擾素、白細(xì)胞介素；某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述另外的藥學(xué)活性劑是免疫治療相關(guān)藥物，例如免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑(例如pd-1、ctla-4或pd-1/ctla-4抑制劑)或免疫系統(tǒng)激活劑(例如tlr、onds、cpg、lps、seb、sea或sec激活劑)；某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述另外的藥學(xué)活性劑是放射性物質(zhì)或顯色劑。

58、用途

59、在第八方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的納米抗體或其抗原結(jié)合片段或其前體藥物(例如probody)、第二方面所述的多特異性抗體、第三方面所述的分離的核酸分子、第四方面所述的載體、第五方面所述的宿主細(xì)胞、第六方面所述的綴合物或第七方面所述的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療和/或輔助治療和/或新輔助治療與msln相關(guān)的疾病的藥物中的用途。

60、在某些實(shí)施方案中，所述與msln相關(guān)的疾病為腫瘤；在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤選自實(shí)體腫瘤或血液腫瘤。

61、在某些實(shí)施方案中，所述實(shí)體腫瘤選自間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、膽管癌、大腸癌、胃癌、輸卵管癌、肺癌或結(jié)直腸癌；所述血液腫瘤包括急性髓性白血?。辉谀承﹥?yōu)選的實(shí)施方案中，所述肺癌為非小細(xì)胞肺癌。

62、在某些實(shí)施方案中，所述納米抗體或其抗原結(jié)合片段、所述多特異性抗體、所述分離的核酸分子、所述載體、所述宿主細(xì)胞、所述綴合物或所述藥物組合物與另外的藥學(xué)活性劑分開、聯(lián)合、同時(shí)或相繼施用。

63、在某些實(shí)施方案中，所述另外的藥學(xué)活性劑為具有抗腫瘤活性的藥物、免疫治療相關(guān)藥物、增強(qiáng)免疫力的藥物或免疫系統(tǒng)激活劑、放射性物質(zhì)或顯色劑。

64、在第九方面，本發(fā)明提供了一種用于在受試者中預(yù)防和/或治療與msln相關(guān)的疾病、和/或延遲與msln相關(guān)的疾病進(jìn)展、和/或降低或抑制與msln相關(guān)的疾病復(fù)發(fā)的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施用有效量的第七方面所述的藥物組合物。

65、在某些實(shí)施方案中，所述與msln相關(guān)的疾病為腫瘤；在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤選自實(shí)體腫瘤或血液腫瘤。

66、在某些實(shí)施方案中，所述實(shí)體腫瘤選自間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、膽管癌、大腸癌、胃癌、輸卵管癌、肺癌或結(jié)直腸癌；所述血液腫瘤包括急性髓性白血??；在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肺癌為非小細(xì)胞肺癌。

67、在某些實(shí)施方案中，其還包括向所述受試者施用第二療法，所述第二療法選自手術(shù)、化療、放療、免疫療法、基因療法、dna療法、rna療法、納米療法、病毒療法、輔助療法、細(xì)胞治療及其任意組合。

68、檢測(cè)應(yīng)用

69、在第十方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中msln存在或其水平的方法，其包括使用本發(fā)明所述的第一方面所述的納米抗體或其抗原結(jié)合片段、第二方面所述的多特異性抗體、第三方面所述的分離的核酸分子或第六方面所述的綴合物；

70、在某些實(shí)施方案中，所述方法是免疫學(xué)檢測(cè)，例如免疫印跡法、酶免疫測(cè)定法(例如，elisa)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、熒光免疫分析法或放射免疫測(cè)定法；

71、在某些實(shí)施方案中，用于所述方法的綴合物包含本發(fā)明的納米抗體或其抗原結(jié)合片段以及可檢測(cè)的標(biāo)記；

72、在某些實(shí)施方案中，用于所述方法的納米抗體或其抗原結(jié)合片段帶有可檢測(cè)的標(biāo)記；

73、在某些實(shí)施方案中，用于所述方法的納米抗體或其抗原結(jié)合片段不帶有可檢測(cè)的標(biāo)記；因此，所述方法還可以包含使用帶有可檢測(cè)的標(biāo)記的其他試劑(例如，第二抗體)來檢測(cè)本發(fā)明的納米抗體或其抗原結(jié)合片段。

74、在第十一方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含本發(fā)明第一方面所述的納米抗體或其抗原結(jié)合片段、第二方面所述的多特異性抗體、第六方面所述的綴合物或第七方面所述的藥物組合物的診斷性或治療性試劑盒。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段帶有可檢測(cè)的標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括第二抗體，其特異性識(shí)別本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段。優(yōu)選地，所述第二抗體還包含可檢測(cè)的標(biāo)記。

75、在第十二方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的納米抗體或抗原結(jié)合片段、第二方面所述的多特異抗體、第三方面所述的核酸分子、第六方面所述的綴合物在制備用于腫瘤診斷或鑒別的試劑盒中的用途。

76、在某些實(shí)施方案中，所述腫瘤選自實(shí)體腫瘤或血液腫瘤；優(yōu)選地，所述實(shí)體腫瘤選自間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、膽管癌、大腸癌、胃癌、輸卵管癌、肺癌或結(jié)直腸癌；所述血液腫瘤包含急性髓性白血?。辉谀承﹥?yōu)選的實(shí)施例中，所述肺癌為非小細(xì)胞肺癌。

77、術(shù)語(yǔ)定義

78、在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的病毒學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。

79、當(dāng)本文使用術(shù)語(yǔ)“例如”、“如”、“諸如”、“包括”、“包含”時(shí)，這些術(shù)語(yǔ)將不被認(rèn)為是限制性術(shù)語(yǔ)，而將被解釋為表示“但不限于”或“不限于”。

80、除非本文另外指明或根據(jù)上下文明顯矛盾，否則術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”和“一種”以及“該”和類似指稱物在描述本發(fā)明的上下文中(尤其在以下權(quán)利要求的上下文中)應(yīng)被解釋成覆蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。

81、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“駝源抗體”是指，經(jīng)免疫接種或抗原入侵的駱駝科動(dòng)物(包括駱駝(camel)、羊駝(alpaca)和大羊駝(l.glama))所產(chǎn)生的針對(duì)該抗原的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在駱駝科動(dòng)物所產(chǎn)生的抗體中存在缺失輕鏈的“重鏈抗體(hcab)”，這種抗體只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)(vhh)和兩個(gè)常規(guī)的ch2與ch3區(qū)，并且單獨(dú)克隆并表達(dá)出來的vhh區(qū)具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與抗原結(jié)合活性，vhh是目前己知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位。

82、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“納米抗體”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義，其是指由單個(gè)單體可變抗體結(jié)構(gòu)域(例如單個(gè)重鏈可變區(qū))所組成的抗體片段，通常來源于重鏈抗體(例如駱駝科動(dòng)物抗體或鯊魚抗體)的可變區(qū)。典型地，納米抗體由4個(gè)框架區(qū)和3個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)組成，具有fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的結(jié)構(gòu)。納米抗體可在n端或c端處截短以使其僅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架區(qū)中的一個(gè)或兩個(gè)，只要其實(shí)質(zhì)上保持抗原結(jié)合和特異性即可。納米抗體也稱為單域抗體(sdab)，兩者可互換使用。

83、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)納米抗體的“抗原結(jié)合片段”是指包含納米抗體的片段的多肽，其保持特異性結(jié)合納米抗體所結(jié)合的相同抗原的能力，和/或與納米抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)抗原的特異性結(jié)合，其也被稱為“抗原結(jié)合部分”。通常參見，fundamental?immunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版,raven?press,n.y.(1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的?？赏ㄟ^重組dna技術(shù)或者通過本發(fā)明納米抗體的酶促或化學(xué)斷裂產(chǎn)生本發(fā)明的納米抗體的抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，所述納米抗體的“抗原結(jié)合片段”與全長(zhǎng)納米抗體相比可在n端或c端截短以使其僅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架區(qū)中的一個(gè)或兩個(gè)，只要其實(shí)質(zhì)上保持抗原結(jié)合和特異性即可。

84、可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)(例如，重組dna技術(shù)或酶促或化學(xué)斷裂法)從給定的納米抗體(例如本發(fā)明提供的納米抗體)獲得納米抗體的抗原結(jié)合片段，并且以與用于完整納米抗體的方式相同的方式就特異性篩選納米抗體的抗原結(jié)合片段。

85、在本文中，除非上下文明確指出，否則當(dāng)提及術(shù)語(yǔ)“納米抗體”時(shí)，其不僅包括完整的納米抗體，而且包括納米抗體的抗原結(jié)合片段。

86、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”是指抗體可變區(qū)中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。在納米抗體中含有三個(gè)cdr，命名為cdr1、cdr2和cdr3。這些cdr的精確邊界可根據(jù)本領(lǐng)域已知的各種編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行定義，例如可按照kabat編號(hào)系統(tǒng)(kabat?et?al.,sequences?of?proteins?of?immunological?interest,5th?ed.public?health?service,national?institutes?of?health,bethesda,md.,1991)、chothia編號(hào)系統(tǒng)(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature?342:878-883)、imgt編號(hào)系統(tǒng)(lefranc?et?al.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)、abm編號(hào)系統(tǒng)(martin?acr，cheetham?jc，rees?ar(1989)modelling?antibody?hypervariable?loops:a?combinedalgorithm.proc?natl?acad?sci?usa?86:9268–9272)或contact編號(hào)系統(tǒng)(maccallum?etal.,(1996).antibody-antigen?interactions:contact?analysis?and?binding?sitetopography.journal?of?molecular?biology，262(5)，732–745)中的定義。對(duì)于給定的納米抗體，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地鑒別各編號(hào)系統(tǒng)所定義的cdr。并且，不同編號(hào)系統(tǒng)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(例如，可參見lefranc?et?al.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)。

87、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“框架區(qū)”或“fr”殘基是指，抗體可變區(qū)中除了如上定義的cdr殘基以外的那些氨基酸殘基。

88、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指，經(jīng)基因工程改造的非人源抗體，其氨基酸序列經(jīng)修飾以提高與人源抗體的序列的同源性。通常而言，人源化抗體的全部或部分cdr區(qū)來自于非人源抗體(供體抗體)，全部或部分的非cdr區(qū)(例如，可變區(qū)fr和或恒定區(qū))來自于人源免疫球蛋白(受體抗體)。人源化抗體通常保留了供體抗體的預(yù)期性質(zhì)，包括但不限于，抗原特異性、親和性、反應(yīng)性、提高免疫細(xì)胞活性的能力、增強(qiáng)免疫應(yīng)答的能力等。供體抗體可以是有預(yù)期性質(zhì)(例如，抗原特異性、親和性、反應(yīng)性、提高免疫細(xì)胞活性的能力和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，食蟹猴)抗體。

89、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”是指，兩分子間的非隨機(jī)的結(jié)合反應(yīng)，如抗體和其所針對(duì)的抗原之間的反應(yīng)。特異性結(jié)合相互作用的強(qiáng)度或親和力可以該相互作用的平衡解離常數(shù)(kd)或半最大效應(yīng)濃度(ec50)表示。

90、兩分子間的特異性結(jié)合性質(zhì)可使用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行測(cè)定。一種方法涉及測(cè)量抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗原復(fù)合物形成和解離的速度。“結(jié)合速率常數(shù)”(ka或kon)和“解離速率常數(shù)”(kdis或koff)兩者都可通過濃度及締合和解離的實(shí)際速率而計(jì)算得出(參見malmqvist?m,nature,1993,361:186-187)。kdis或kon的比率等于解離常數(shù)kd(參見davies等人,annual?rev?biochem,1990；59:439-473)?？捎萌魏斡行У姆椒y(cè)量kd、kon和kdis值。

91、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“載體”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運(yùn)載工具。當(dāng)載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達(dá)時(shí)，載體稱為表達(dá)載體。載體可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于：質(zhì)粒；噬菌粒；柯斯質(zhì)粒；人工染色體，例如酵母人工染色體(yac)、細(xì)菌人工染色體(bac)或p1來源的人工染色體(pac)；噬菌體如λ噬菌體或m13噬菌體及動(dòng)物病毒等?？捎米鬏d體的動(dòng)物病毒包括但不限于，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如sv40)。一種載體可以含有多種控制表達(dá)的元件，包括但不限于，啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報(bào)告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。

92、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指，可用于導(dǎo)入載體的細(xì)胞，其包括但不限于，如大腸桿菌或枯草菌等的原核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或曲霉菌等的真菌細(xì)胞，如s2果蠅細(xì)胞或sf9等的昆蟲細(xì)胞，或者如纖維原細(xì)胞，cho細(xì)胞，cos細(xì)胞，nso細(xì)胞，hela細(xì)胞，bhk細(xì)胞，hek?293細(xì)胞或人細(xì)胞等的動(dòng)物細(xì)胞。

93、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“同一性”用于指兩個(gè)多肽之間或兩個(gè)核酸之間序列的匹配情況。為了測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的百分比同一性，為了最佳比較目的將序列進(jìn)行比對(duì)(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以與第二氨基酸或核酸序列最佳比對(duì))。然后比較對(duì)應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中的對(duì)應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置上是同一的。兩個(gè)序列之間的百分比同一性是由序列所共享的同一性位置的數(shù)目的函數(shù)(即，百分比同一性＝同一重疊位置的數(shù)目/位置的總數(shù)×100％)。在某些實(shí)施方案中，兩個(gè)序列長(zhǎng)度相同。

94、兩個(gè)序列之間的百分比同一性的測(cè)定還可使用數(shù)學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)。用于兩個(gè)序列的比較的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)非限制性實(shí)例是karlin和altschul的算法，1990,proc.natl.acad.sci.u.s.a.87:2264-2268，如同karlin和altschul,1993,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:5873-5877中改進(jìn)的。將這樣的算法整合至altschul等人,1990,j.mol.biol.215:403的nblast和xblast程序中。

95、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“保守置換”意指不會(huì)不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白或多肽的預(yù)期性質(zhì)的氨基酸置換。例如，可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如定點(diǎn)誘變和pcr介導(dǎo)的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學(xué)上或功能上與相應(yīng)的氨基酸殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價(jià)鍵或氫鍵的能力等)的殘基進(jìn)行的置換。已在本領(lǐng)域內(nèi)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一個(gè)氨基酸殘基替代相應(yīng)的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守置換的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(參見，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人protein?eng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.set?usa?94:412-417(1997)，其通過引用并入本文)。

96、本文涉及的二十個(gè)常規(guī)氨基酸的編寫遵循常規(guī)用法。參見例如，immunology-asynthesis(2nd?edition,e.s.golub?and?d.r.gren,eds.,sinauer?associates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”具有相同的含義且可互換使用。并且在本發(fā)明中，氨基酸通常用本領(lǐng)域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。

97、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學(xué)和/或生理學(xué)上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領(lǐng)域公知的(參見例如remington's?pharmaceutical?sciences.edited?by?gennaro?ar,19thed.pennsylvania:mack?publishing?company,1995)，并且包括但不限于：ph調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、佐劑、離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑、稀釋劑、維持滲透壓的試劑、延遲吸收的試劑、防腐劑。

98、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”是指，為了阻止或延遲疾病或病癥或癥狀在受試者體內(nèi)的發(fā)生而實(shí)施的方法。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”是指，為了獲得有益或所需臨床結(jié)果而實(shí)施的方法。為了本發(fā)明的目的，有益或所需的臨床結(jié)果包括(但不限于)減輕癥狀、縮小疾病的范圍、穩(wěn)定(即，不再惡化)疾病的狀態(tài)，延遲或減緩疾病的發(fā)展、改善或減輕疾病的狀態(tài)、和緩解癥狀(無(wú)論部分或全部)，無(wú)論是可檢測(cè)或是不可檢測(cè)的。此外，“治療”還可以指，與期望的存活期相比(如果未接受治療)，延長(zhǎng)存活期。

99、如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”是指哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物，例如人。在某些實(shí)施方案中，所述受試者(例如人)患有腫瘤(例如表達(dá)msln的腫瘤)，或者，具有患有上述疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

100、術(shù)語(yǔ)“癌癥”、“腫瘤”可互換使用，其是指以體內(nèi)異常細(xì)胞的不受控生長(zhǎng)為特征的一大類疾病。不受管制的細(xì)胞分裂可能導(dǎo)致惡性腫瘤或侵入鄰近組織的細(xì)胞的形成，并可能通過淋巴系統(tǒng)或血流轉(zhuǎn)移到身體的遠(yuǎn)端部位。癌癥包括良性和惡性癌癥以及休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移。癌癥也包括血液學(xué)惡性腫瘤。

101、在本文中，“組合”包括可以分開施用的療法，例如針對(duì)單獨(dú)投藥分開調(diào)配(例如，可以在試劑盒中提供)，及可以按單一調(diào)配物(亦即“共調(diào)配物”)一起施用的療法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗msln納米抗體或其抗原結(jié)合片段可依次序施用。在其他實(shí)施方案中，抗msln納米抗體或其抗原結(jié)合片段可同時(shí)施用。本發(fā)明的抗msln納米抗體或其抗原結(jié)合片段可以與至少一種其他(活性)藥劑以任何方式組合使用。

102、發(fā)明的有益效果

103、本發(fā)明的特異性結(jié)合msln的納米抗體或抗原結(jié)合片段與msln具有良好的結(jié)合親和力。因此，本發(fā)明的特異性結(jié)合msln的納米抗體或抗原結(jié)合片段或多特異性抗體適用于預(yù)防和/或治療與msln相關(guān)的疾病或病癥，具有重大的臨床價(jià)值。