(一)本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種對甲硫醇鈉耐受性提升的o-琥珀酰-l-高絲氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

0、(二)背景技術(shù)

1、l-甲硫氨酸是人體和動物所必須的唯一含硫氨基酸，在醫(yī)藥、食品、飼料等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，其綠色高效合成受到了廣泛關(guān)注。目前，l-甲硫氨酸的主流合成方法為化學(xué)法，但是過程中使用氫氰酸和甲硫醇等高揮發(fā)性有毒底物、反應(yīng)條件苛刻、三廢排放大，其應(yīng)用越來越受到限制。而構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠直接進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，由于代謝合成路徑復(fù)雜，代謝調(diào)控困難，目前難以實現(xiàn)工業(yè)化。相比之下，發(fā)酵-酶催化耦合路線是l-甲硫氨酸合成的重要方法，以葡萄糖為底物，發(fā)酵生產(chǎn)前體o-琥珀酰-l-高絲氨酸，進(jìn)一步在o-琥珀酰-l-高絲氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶(metz)作用下與甲硫醇反應(yīng)生成l-甲硫氨酸，原子經(jīng)濟(jì)性高、三廢排放少，具有重要應(yīng)用前景。

2、metz是一種依賴于吡哆醛的磷酸酶折疊ⅰ型，其結(jié)構(gòu)可分為二聚體和四聚體，需要5′-磷酸吡哆醛(plp)作為輔因子。metz是一種具有相似亞基的四聚體蛋白。每個單體都由三個亞區(qū)組成，分別是n-末端結(jié)構(gòu)域、plp結(jié)合域和c-末端結(jié)構(gòu)域。n-末端結(jié)構(gòu)域具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)從單體的主體部位突出，形成對鄰近單體的夾持。每個單體內(nèi)的plp結(jié)合域上都有一個β-折疊，其中包含活性位點，在該活性位點附近的賴氨酸通過席夫堿鍵(schiff)與plp輔因子結(jié)合，此外該活性部位需要另一個單體的n-末端結(jié)構(gòu)域通過鹽橋連接到plp的磷酸基團(tuán)上。c-末端結(jié)構(gòu)域帶有輕微扭曲的反平行β-折疊，與plp結(jié)合域結(jié)合，有助于形成致密的單體形狀。近年來，基于metz結(jié)構(gòu)與功能的構(gòu)效關(guān)系研究，對metz進(jìn)行改造獲得了活力提升的突變體，應(yīng)用于催化osh和甲硫醇鈉合成l-甲硫氨酸中(adv.synth.catal.2023,365,1048-1057)。但是，研究發(fā)現(xiàn)，以甲硫醇鈉作為巰基供體時，其添加濃度的提高限制了反應(yīng)速率，而metz在高濃度甲硫醇鈉條件下耐受性差是主要原因，因此，開發(fā)在高濃度甲硫醇鈉條件下耐受性好的metz，以滿足發(fā)酵-酶法合成l-蛋氨酸的工業(yè)需求具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

0、(三)
技術(shù)實現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明目的是提供一種對甲硫醇鈉耐受性提升的o-琥珀酰-l-高絲氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用，

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供一種對甲硫醇鈉耐受性提高的o-琥珀酰-l-高絲氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶突變體(記為metz-m)，所述突變體是將seq?id?no.1所示來源于紫色桿菌chromobacteriumviolaceum的o-琥珀酰-l-高絲氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的第59位、第119位進(jìn)行單突變或多突變獲得的。

4、進(jìn)一步，所述o-琥珀酰-l-高絲氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶突變體是將seq?id?no.1所示氨基酸序列突變?yōu)橄铝兄唬?1)第59位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?其氨基酸序列如seq?idno.2所示，記為metz-m1；(2)第119位的蘇氨酸突變?yōu)槔野彼?其氨基酸序列如seq?id?no.3所示，記為metz-m2；(3)第59位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼嵋约暗?19位的蘇氨酸突變?yōu)槔野彼?，其氨基酸序列如seq?id?no.4所示，記為metz-m3。

5、本發(fā)明提供所述o-琥珀酰-l-高絲氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼基因，重組質(zhì)粒及重組基因工程菌，所述重組質(zhì)粒優(yōu)選以pet-28b為基礎(chǔ)質(zhì)粒，以大腸桿菌e.coli?bl21(de3)為宿主菌。

6、本發(fā)明還提供一種所述o-琥珀酰-l-高絲氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶突變體在催化甲硫醇鈉生產(chǎn)l-甲硫氨酸中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為：以含所述o-琥珀酰-l-高絲氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶突變體編碼基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體超聲破碎提取的純酶液為催化劑，以o-琥珀酰-l-高絲氨酸(osh)和甲硫醇鈉為底物，以ph7-9的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在30℃，800rpm的恒溫震蕩金屬浴中反應(yīng)，反應(yīng)液分離純化，獲得l-甲硫氨酸。

7、進(jìn)一步，所述反應(yīng)體系中，濕菌體加入量為5-15g/l(優(yōu)選10g/l)；純酶液加入量以蛋白濃度計為50-150mg/l(優(yōu)選100mg/l)；o-琥珀酰-l-高絲氨酸(osh)加入濃度20-80g/l(優(yōu)選50g/l)；甲硫醇鈉體積加入濃度1-15％。

8、進(jìn)一步，所述反應(yīng)體系中還含有5′-磷酸吡哆醛(plp)，加入終濃度為10-50mm。

9、進(jìn)一步，所述緩沖液為2m，ph?8.0的tris-hcl緩沖液。

10、進(jìn)一步，所述催化劑按如下方法制備：

11、(1)將含o-琥珀酰-l-高絲氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶突變體編碼基因的工程菌接種至含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃、180r/min培養(yǎng)10-12h，獲得種子液；將種子液以體積濃度1％接種量接種至新鮮的含有終濃度50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，于37℃、180r/min培養(yǎng)od600至0.6～0.8，再向培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1mm的iptg，于28℃下誘導(dǎo)表達(dá)12h后，4℃、8000r/min離心10min，棄去上清液，收集濕菌體；

12、(2)將濕菌體用tris-hcl緩沖液(100mm，ph8.0)重懸，采用超聲破碎法進(jìn)行破碎，破碎程序為：破碎時間3s，間隔時間4s，功率40w(注意：菌液應(yīng)冰浴破碎)，破碎結(jié)束后，懸浮液呈現(xiàn)透亮的土黃色，將細(xì)胞破碎液于4℃，12000rpm離心20min，收集上清液；

13、(3)上清液經(jīng)過0.22μm濾膜超濾后裝載于ni-nta凝膠柱，采用重力法控制流速上樣，使用含有300mm?nacl，50mm咪唑的ph?8.0、50mm?tris-hcl緩沖液洗脫，流速1.0ml/min，對一些雜蛋白以及未結(jié)合的蛋白進(jìn)行洗脫，直至蛋白純化儀上的紫外檢測達(dá)平衡；再使用含有300mm?nacl，50mm咪唑的ph?8.0、500mm?tris-hcl緩沖液洗脫，流速1.0ml/min，收集目的蛋白的洗脫液；將洗脫液裝入透析袋(mwco為100000)，以純水為透析液，在4℃冰箱過夜透析，收集截流液，得到純酶液。

14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：

15、(1)本發(fā)明通過半理性設(shè)計，定點突變技術(shù)改造metz，最終獲得了在不損失酶活力的情況下對高濃度甲硫醇鈉環(huán)境下耐受性提高的突變體。本發(fā)明的突變體對甲硫醇鈉的耐受性大幅提高，由突變前的5％提高到15％，具有很大工業(yè)價值。

16、(2)分別在5％，10％，15％的甲硫醇鈉下孵育，突變體t59i、t119y、t59i/t119y的半衰期相對于野生型的半衰期提升了300％-360％，其中突變體t59i/t119y半衰期較wt提升最高為360％。突變體t59i、t119y、t59i/t119y在10小時的殘余酶活相對與wt提升了190％～210％，其中突變體t59i殘余酶活相對與wt提升最高為210％。

17、(3)本發(fā)明突變體對底物的轉(zhuǎn)化率顯著提高。在10％甲硫醇鈉的體系中，wt反應(yīng)1.5h后轉(zhuǎn)化率不再增加，最高轉(zhuǎn)化率為32％。突變體t59i、t119y反應(yīng)大概4h后轉(zhuǎn)化率不再增加，其中突變體t59i轉(zhuǎn)化率最高位60％，突變體t119y轉(zhuǎn)化率為52％，對比wt均有提高，有利于生產(chǎn)應(yīng)用。

18、(四)具體實施方式

19、下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

20、lb液體培養(yǎng)基組成：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l，溶于蒸餾水中；lb固體培養(yǎng)基在lb液體培養(yǎng)基中添加20g/l瓊脂粉；121℃高壓滅菌20min；使用前添加終濃度100μg/ml卡那霉素。

21、實施例1、metz酶活測定

22、1、野生型重組基因工程菌的構(gòu)建

23、人工合成來源于紫色桿菌chromobacterium?violaceum的o-琥珀酰-l-高絲氨酸巰基轉(zhuǎn)移酶(metz，geneid:mk948096.1，氨基酸序列如seq?id?no.1所示)的編碼基因，表達(dá)載體為pet-28b，宿主細(xì)胞為e.coli?bl21(de3)，篩選陽性克隆，獲得野生型重組基因工程菌e.coli?bl21(de3)-pet-28b-metz，記為wt。

24、2、野生型重組工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)

25、將步驟1構(gòu)建的野生型重組基因工程菌接種至含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃、180r/min培養(yǎng)10-12h，獲得種子液；將種子液以體積濃度1％接種量接種至新鮮的含有終濃度50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，于37℃、180r/min培養(yǎng)od600至0.6～0.8，再向培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1mm的iptg，于28℃下誘導(dǎo)表達(dá)12h后，4℃、8000r/min離心10min，棄去上清液，取濕菌體并使用tris-hcl緩沖液(100mm，ph8.0)重懸濕菌體使其濃度為0.1g/l，備用。

26、3、野生型重組基因工程菌超聲破碎

27、步驟2的菌懸液采用超聲破碎法進(jìn)行破碎。冰浴破碎程序為：破碎時間3s，間隔時間4s，功率40w。破碎結(jié)束后，懸浮液呈現(xiàn)透亮的土黃色。最后，將細(xì)胞破碎液于4℃，12000rpm離心20min，收集上清液。

28、4、酶分離純化

29、步驟3的上清液經(jīng)過0.22μm濾膜超濾后裝載于ni-nta凝膠柱，采用重力法控制流速上樣，使用含有300mm?nacl，50mm咪唑的ph?8.0、50mm?tris-hcl緩沖液(hcl調(diào)至ph為8.0后過膜超聲)進(jìn)行洗脫，流速1.0ml/min，對一些雜蛋白以及未結(jié)合的蛋白進(jìn)行洗脫，直至蛋白純化儀上的紫外檢測達(dá)平衡。再使用含有300mm?nacl，50mm咪唑的ph?8.0、500mm?tris-hcl緩沖液(hcl調(diào)至ph為8.0后過膜超聲)洗脫，流速1.0ml/min，收集目的蛋白的洗脫液；將洗脫液裝入透析袋(mwco為100000)，以純水為透析液，在4℃冰箱過夜透析，收集截流液，得到純酶液，經(jīng)過sds凝膠電泳分析，得到條帶正確的、高純度的純酶液，留存?zhèn)溆谩?/p>

30、5、metz酶活性測定

31、(1)標(biāo)準(zhǔn)酶活檢測

32、在2ml反應(yīng)體系中，加入蛋白濃度0.1g/l溶于tris-hcl緩沖液(2m，ph?8.0)的純酶液metz，在30℃下保溫5min，加入終濃度為50g/l?osh和1％(v/v)甲硫醇鈉，于30℃，800rpm的恒溫震蕩金屬浴中反應(yīng)5min。反應(yīng)結(jié)束后，取200μl反應(yīng)液，加入10μl?6m?hcl終止反應(yīng)。催化反應(yīng)結(jié)束后，于12000rpm離心1min，取上清，稀釋，經(jīng)衍生化后通過高效液相色譜(hplc)法測定產(chǎn)物l-甲硫氨酸的生成量，計算初始酶活。

33、(2)plp對酶活的影響

34、步驟(1)同樣的條件下，向反應(yīng)體系中添加終濃度10mm的5′-磷酸吡哆醛(plp)，其他操作相同。步驟(1)不添加輔酶plp的野生型純酶液酶活為71.30u/mg，步驟(2)添加plp的野生型純酶液酶活為106.02u/mg。

35、(3)甲硫醇鈉濃度對酶活的影響

36、步驟(1)中甲硫醇鈉的體積加入濃度分別改為1％、5％、10％、15％，于30℃，800rpm的恒溫震蕩金屬浴中反應(yīng)5min改為30min，其他操作相同。以metz在1％甲硫醇鈉體系中的酶活為100％，計算相對酶活，metz在5％甲硫醇鈉體系中的酶活為79.3％，在10％甲硫醇鈉體系中的酶活為53.3％，在15％甲硫醇鈉體系中的酶活為39.7％。

37、酶活力定義：每分鐘生成1μmol?l-甲硫氨酸所需要的酶量定義為一個酶活力單位(u)。

38、酶比活力(u·mg-1)定義為：每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)。

39、酶比活力計算公式為：酶比活力(u·mg-1)＝酶活力(u)/蛋白量(mg)。

40、hplc檢測方法：

41、衍生化試劑的配置：稱取0.27g?4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯(cnbf)與10ml乙腈混合，配制成母液，避光保存。

42、硼酸-硼砂緩沖液的配置：按照硼酸終濃度0.2mol/l與硼砂終濃度0.05mol/l，將硼酸和硼砂分別用無菌水溶解后混合，超聲溶解。

43、樣品衍生化：將100μl樣品、300μl衍生化試劑與500μl硼酸-硼砂緩沖液混合，在60℃，400rpm的恒溫震蕩金屬浴中避光反應(yīng)1h，后用0.22μm有機(jī)相過濾器過濾。濾液通過hplc分析方法對產(chǎn)物l-甲硫氨酸濃度進(jìn)行定量分析。流動相的配置：流動相分為兩瓶，其中流動相a為純乙腈，流動相b按照水：乙腈：三乙胺：乙酸＝850：150：2：7的比例配置，后過膜超聲。色譜柱：welchromc18柱(4.6mm×250mm，5μm)；工作溫度：30℃。紫外檢測波長：260nm；流速：0.8ml/min。洗脫方法：l-甲硫氨酸的檢測采用梯度洗脫的方式，具體方法如表1所示。

44、表1hplc檢測體系

45、

46、實施例2、metz單點突變體的構(gòu)建與篩選

47、1.突變位點的選擇

48、使用swiss-model工具對野生型metz進(jìn)行蛋白質(zhì)模擬建模，并利用pymol和caver軟件對該酶的活性中心及底物通道進(jìn)行預(yù)測，結(jié)合分子動力學(xué)模擬和計算機(jī)虛擬篩選，預(yù)測并錨定影響對甲硫醇鈉耐受性的t59和t119位點，進(jìn)行定點突變。

49、2.突變體的構(gòu)建

50、根據(jù)metz的核苷酸序列(geneid:mk948096.1)，設(shè)計突變引物，利用全質(zhì)粒pcr技術(shù)，以重組載體pet28b-metz為模板，對seq?id?no.1所示metz氨基酸序列引入單點突變，所用引物如表2所示。

51、表2突變體構(gòu)建的引物設(shè)計

52、

53、pcr反應(yīng)體系：2×phanta?max?buffer?25μl，正/反向引物2μl，模板dna1μl，加入ddh2o至50μl。

54、pcr擴(kuò)增條件為：98℃5min；(98℃30s，60℃30s，72℃2000bp/min)；35循環(huán)；72℃，10min。

55、向pcr產(chǎn)物中加入dpni酶0.5μl、duffer1μl，37℃1h、70℃15min。取10μl的pcr產(chǎn)物，加入100μl冰浴的e.coli?bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中，冰上靜置30min后立即42℃熱激90s，冰浴2～5min后加入lb培養(yǎng)基600μl，37℃復(fù)蘇1h，4000r/min離心1min，棄掉部分上清，將剩余的菌液懸浮后涂lb平板(含卡那霉素，終濃度50μg/ml)，37℃倒置培養(yǎng)12h。

56、3.重組工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)

57、從平板上挑取單克隆于5ml含終濃度50μg/ml卡那霉素lb試管中，于37℃，180rpm培養(yǎng)12h。按照2％(v/v)接種量轉(zhuǎn)接至100ml含終濃度50μg/ml卡那霉素lb液體培養(yǎng)基中，于37℃、180rpm培養(yǎng)2～3h(od600＝0.6～0.8)，加入iptg(終濃度為0.1mm)，于28℃，180rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。培養(yǎng)結(jié)束后，于4℃，8000rpm離心10min，棄上清，收集濕菌體。

58、3.突變體的篩選

59、在tris-hcl緩沖液(2m，ph?8.0)中按照10g/l的量加入濕菌體，在30℃下保溫5min，再加入終濃度50g/l?osh和1％(v/v)甲硫醇鈉構(gòu)成2ml反應(yīng)體系，于30℃，800rpm的恒溫震蕩金屬浴中反應(yīng)5min。反應(yīng)結(jié)束后，采用實施例1方法測定產(chǎn)物l-甲硫氨酸的生成量，以metz在1％甲硫醇鈉體系中的酶活為100％，計算相對酶活。

60、同樣條件下，將甲硫醇鈉體積濃度改為5％、10％、15％，其他操作相同，相對酶活見表3，t59i和t119y在不同濃度甲硫醇鈉中進(jìn)行孵育后，其殘留酶活均有顯著提高。

61、表3metz及其突變體對甲硫醇鈉耐受性

62、

63、實施例3、飽和突變體的構(gòu)建與篩選

64、根據(jù)實施例2構(gòu)建的單突變體序列設(shè)計定點飽和突變的突變引物，利用全質(zhì)粒pcr技術(shù)，以重組載體pet28b/metz為模板，對metz氨基酸序列的59位和119位進(jìn)行飽和突變。引物序列如表4所示。

65、表4metz?59和119位點的飽和突變引物設(shè)計

66、

67、n代表a/t/g/c，k代表g/t。

68、采用實施例2方法構(gòu)建突變體并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和篩選，結(jié)果如表5所示。

69、表5metz?59和119位點飽和突變體對不同濃度甲硫醇鈉耐受性的篩選結(jié)果

70、

71、實施例4、組合突變體的構(gòu)建與篩選

72、根據(jù)實施例2構(gòu)建的單突變體序列設(shè)計組合突變，利用全質(zhì)粒pcr技術(shù)，以重組載體pet28b/metz為模板，對metz氨基酸序列的59、119位進(jìn)行組合突變。

73、采用實施例2方法構(gòu)建突變體并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和篩選，結(jié)果如表6所示。

74、表6metz?t59i/t119y組合突變體對不同濃度甲硫醇鈉的耐受性

75、

76、經(jīng)過檢測，突變體t59i/t119y相比wt耐受性有進(jìn)一步的提升。

77、實施例5、metz及其突變體對甲硫醇鈉耐受性的測定

78、采用實施例1方法分別制備得到wt及其突變體t59i、t119y、t59i/t119y的濕菌體，采用實施例1方法檢測濕菌體在10％的甲硫醇鈉條件下的酶活。

79、結(jié)果表明，突變體t59i、t119y、t59i/t119y的半衰期相對于wt的提升了300％～360％，其中突變體t59i/t119y半衰期較wt提升最高為360％。突變體t59i、t119y、t59i/t119y在10小時的殘余酶活相對與wt提升了190％～210％，其中突變體t59i殘余酶活相對與wt提升最高為210％，說明突變體對甲硫醇鈉的耐受性明顯提高。

80、實施例6、metz及其突變體對轉(zhuǎn)化率的測定

81、采用實施例1方法分別制備得到wt及其突變體t59i、t119y和t59i/t119y的濕菌體，用于底物轉(zhuǎn)化。

82、在10ml反應(yīng)體系中，加入10g/l溶于tris-hcl緩沖液(2m，ph?8.0)中的上述濕菌體，在30℃下保溫5min后，一次性投入終濃度為60g/l?osh、10.0％(v/v)甲硫醇鈉以及50mmplp，在30℃，800rpm恒溫震蕩金屬浴中持續(xù)反應(yīng)。前3h，每隔30min取一次樣，之后每隔1h取一次樣，至8h結(jié)束。通過氨基酸分析儀測定底物osh的殘余量，計算轉(zhuǎn)化率。

83、wt反應(yīng)1.5h后轉(zhuǎn)化率不再增加，最高轉(zhuǎn)化率為32％。突變體t59i、t119y反應(yīng)大概4h后轉(zhuǎn)化率不再增加，其中突變體t59i轉(zhuǎn)化率最高位60％，突變體t119y轉(zhuǎn)化率為52％，突變體t59i/t119y轉(zhuǎn)化率最高達(dá)64％，對比wt均有提高，有利于生產(chǎn)應(yīng)用。