外源基因轉(zhuǎn)化浮萍并進行表達的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種將外源基因快速高效轉(zhuǎn)化入浮萍并進行表 達的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 浮萍為單子葉水生漂浮植物，為最小的開花植物之一。因其結(jié)構(gòu)簡單，增殖快，不 僅被廣泛應(yīng)用于植物生理學(xué)、遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)和環(huán)境檢測等方面，而且被廣泛應(yīng)用于水體污 染的治理。實驗室培養(yǎng)的浮萍葉狀體從分生細胞處以類似于酵母無性繁殖的營養(yǎng)出芽方式 快速增殖，因此遺傳非常穩(wěn)定；浮萍生物量平均每2-3天繁殖1代，生物量增加快，生產(chǎn)周期 短；表達產(chǎn)物產(chǎn)量高且容易分離純化；浮萍可用來生產(chǎn)在細菌和酵母中不易表達的復(fù)雜蛋 白質(zhì)，浮萍還可用來表達在哺乳表達系統(tǒng)受限或耗資太高的蛋白；嚴格的無菌培養(yǎng)使其不 易受病毒的感染，其表達的疫苗安全性高；浮萍相對于其他植物來說不需要田地來進行種 植生長，可通過采用野外有營養(yǎng)的廢水來低廉生產(chǎn)有價值的融合蛋白或肽，而且還能凈化 廢水供再利用；浮萍可在發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中生長，使其更容易整合入現(xiàn)存的蛋白質(zhì)生 產(chǎn)工業(yè)基礎(chǔ)建設(shè)中；因此采用浮萍作為植物生物反應(yīng)器系統(tǒng)在生產(chǎn)重組蛋白方面具有良好 的應(yīng)用前景。
[0003] 目前已經(jīng)有兩種浮萍成功開發(fā)為商業(yè)化生物反應(yīng)器，分別是美國BIOLEX公司的 LEX SystemTM表達系統(tǒng)和法國LemnaGene公司的LemnaGeneTM SA表達系統(tǒng)，二者價格都很 昂貴。國內(nèi)以浮萍作為表達系統(tǒng)還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問題，本發(fā)明提供一種外源基因轉(zhuǎn)化浮萍并進行表達的方法，包括如 下步驟：
[0005] 步驟一：將外源基因轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，獲得重組農(nóng)桿菌；然后配制農(nóng)桿菌重懸液；
[0006] 步驟二：在所述浮萍葉狀體區(qū)域割劃若干處，然后將所述割劃后的浮萍葉狀體在 所述農(nóng)桿菌重懸液中浸泡l〇-15min，通過所述重組農(nóng)桿菌將所述外源基因生長到所述浮萍 葉狀體中；然后將所述浮萍葉狀體移植入鋪有無菌濾紙的共培養(yǎng)基中，室溫下避光培養(yǎng)3 天以上。
[0007] 優(yōu)選地，所述農(nóng)桿菌重懸液的配制步驟為：挑取重組農(nóng)桿菌單菌落在YEB固體培 養(yǎng)基上活化；活化完成后的重組農(nóng)桿菌單菌落再接種到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中，26~30°C生長 過夜，獲得重組農(nóng)桿菌菌液；然后按照體積比為1:50~100將所述重組農(nóng)桿菌菌液接種于 含有50mg/L卡那霉素，10mg/L利福平和20mg/L乙酰丁香酮的YEB液體培養(yǎng)基中形成接種 液，于26~30°C振搖至使所述接種液在波長為600nm的吸光度值為I. 0 ;最后將所述接種 液重懸于含3%蔗糖，20mg/L乙酰丁香酮和0. 6M甘露醇的1/2MS固體培養(yǎng)基中，得到農(nóng)桿 菌重懸液。
[0008] 優(yōu)選地，所述步驟二還包括對浮萍的預(yù)處理：在SH培養(yǎng)基含1 %蔗糖和10 μ M吲 哚乙酸中于23°C，在光生物反應(yīng)器中16h光照/8h黑暗，40 μ mol/m2 .sec預(yù)培養(yǎng)2周以上。
[0009] 優(yōu)選地，還包括一正交試驗，即選用抗生素水溶液，濃度分別為0、5、10、20和 40mg/L ;每個濃度處理若干組浮萍葉狀體，重復(fù)若干次；植物激素水溶液，濃度分別各為0、 0. 5、1、2和5mg/L ;每個濃度處理若干組浮萍葉狀體，重復(fù)若干次，通過分析極差值找出未 經(jīng)過轉(zhuǎn)化的浮萍在抗生素、植物激素影響下的最佳生長條件。
[0010] 優(yōu)選地，所述農(nóng)桿菌重懸液中所述重組農(nóng)桿菌的濃度為lX108cfu/ml~ I X 109cfu/ml 〇
[0011] 優(yōu)選地，所述外源基因為pcambia-1300-GFP雙元質(zhì)粒；所述農(nóng)桿菌為EHA105。
[0012] 有益效果：
[0013] 1、本發(fā)明選用pcambia-1300-GFP雙元質(zhì)粒作為外源基因的載體重組農(nóng)桿菌 EHA105,該載體具有插入片段長，轉(zhuǎn)化效率高的特點，能夠很方便地將復(fù)雜的外源基因整合 到載體上；
[0014] 2、本發(fā)明采用pcambia-1300-GFP雙元質(zhì)粒作為外源基因的載體，該載體表達產(chǎn) 物為綠色熒光蛋白，在熒光顯微鏡下激發(fā)后發(fā)綠色熒光，可以方便觀察陽性轉(zhuǎn)化浮萍株。
[0015] 3、本發(fā)明采用浮萍葉狀體直接作為轉(zhuǎn)化受體，不必經(jīng)過愈傷組織，該方法操作方 便，轉(zhuǎn)化效率高，大大簡化了將外源基因轉(zhuǎn)化到宿主植株浮萍的操作，轉(zhuǎn)化陽性率大大提 尚；
[0016] 3、本發(fā)明選用浮萍作為表達宿主植株，其結(jié)構(gòu)簡單，增殖快，遺傳穩(wěn)定；可用來生 產(chǎn)在細菌和酵母中不易表達的復(fù)雜蛋白質(zhì)；嚴格的無菌培養(yǎng)使其不易受病毒的感染，其表 達的疫苗安全性高；相對于其他植物來說不需要田地來進行種植生長，可通過采用野外有 營養(yǎng)的廢水來低廉生產(chǎn)有價值的融合蛋白或肽，而且還能凈化廢水供再利用；浮萍可在發(fā) 酵罐或生物反應(yīng)器中生長，使其更容易整合入現(xiàn)存的蛋白質(zhì)生產(chǎn)工業(yè)基礎(chǔ)建設(shè)中因此采用 浮萍作為植物生物反應(yīng)器系統(tǒng)來生產(chǎn)重組蛋白優(yōu)越性是十分顯著的。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明雙元質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞過程的提取質(zhì)粒電泳圖；
[0018] Ml--DL2000 DNA Marker ； 1--pcambia-1300-GFP 雙元質(zhì)粒；M2--λ /Hind III DNA marker〇
[0019] 圖2為本發(fā)明雙元質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞陽性克隆鑒定圖。
[0020] Ml--DL2000 DNA Marker ；1--GFP forward-GFP reverse 引物擴增后 的 pcambia-1300-GFP 雙元質(zhì)粒產(chǎn)物；2, 3--GFP forward-GFP reverse 引物擴增 pcambia-1300-GFP雙元質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后的克隆產(chǎn)物。
[0021] 圖3為本發(fā)明浮萍葉狀體在含有不同濃度潮霉素，6-芐基嘌呤和萘乙酸培養(yǎng)基中 生長4周后再生情況。
[0022] 圖4A、4B為本發(fā)明含有pcambia-1300-GFP雙元質(zhì)粒載體的浮萍植株中綠色熒光 蛋白的表達圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面，將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作詳細說明。
[0024] 現(xiàn)有技術(shù)中引入外源基因的方法大多集中在選用愈傷組織作為轉(zhuǎn)化對象，增加了 實驗的難度和培養(yǎng)周期。本發(fā)明提供一種利用浮萍表達外源基因的方法。其中，本發(fā)明所 選用的外源基因載體為pcambia-1300-GFP雙元質(zhì)粒；該雙元載體上已經(jīng)整合有報告基因 GFP，并帶有多克隆位點，方便外源基因的插入。轉(zhuǎn)化的對象為農(nóng)桿菌EHA105。該農(nóng)桿菌 EHA105含有輔助Ti質(zhì)粒，具有轉(zhuǎn)化效率高的特點。
[0025] 本發(fā)明中采用了多種培養(yǎng)基，具體組分如下：
[0026] (I)YEB液體培養(yǎng)基：是用作農(nóng)桿菌培養(yǎng)基。本發(fā)明根據(jù)分子克隆加以修改，即將 下列組分溶解在0. 9L水中：胰蛋白胨5g，酵母提取物lg，營養(yǎng)肉湯5g，蔗糖5g，MgS04 ·7Η20 0. 5g，各組分溶解后用lmol/L NaOH調(diào)整pH至7. 2,再補足水至1L，高壓滅菌。
[0027] YEB固體培養(yǎng)基，是在YEB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂粉15_20g/L。
[0028] (2) 1/2MS固體培養(yǎng)基：每升水中溶解有0. 825g/L的NH4N03、0. 95g/L的ΚΝ03、 0.085g/L 的 KH2P04、0.185g/L 的 MgS04.7H20、0.220g/L 的 CaCl2.2H20、0.83mg/L 的 KI、6.2mg/L 的 H3B03、22.3mg/L 的 MnS04.4H20、8.6mg/L 的 ZnS04,7H20、0.25mg/L 的 Na2MoO4 ·2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 ·5Η20、0· 025π^/1 的 CoCl2 ·6Η20、27. 8mg/L 的 FeSO4 ·7Η20、 37. 3mg/L 的 EDTA-Na2 · 2Η20、2· Omg/L 甘氨酸、0· lmg/L 鹽酸硫胺素（VBl)、0· 5mg/L 鹽酸吡 哆醇（VB6)、0· 5mg/L煙酸、100mg/L肌醇、0· 4 %瓊脂，0· 2 %植物凝膠。
[0029] (3)共培養(yǎng)基：含3%蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮、0· 5mg/L 6-芐基嘌呤的1/2MS固 體培養(yǎng)基。
[0030] 具體包括如下步驟：
[0031] 步驟一：將雙元載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，得到重組農(nóng)桿菌；然后配制形成農(nóng)桿 菌懸液。
[0032] (1)將雙元載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中。根據(jù)分子克隆手冊，制作農(nóng)桿菌感受態(tài)細 胞，然后將50~IOOng pcambia-1300-GFP雙元質(zhì)粒加入100 μ 1所述農(nóng)桿菌感受態(tài)中，混 勾成菌懸液，冰上放置30min ;放于液氮或-70°C預(yù)冷的工業(yè)酒精中速凍3~5min，再放于 28°C水浴5min。然后在所述菌懸液中進一步加入YEB液體培養(yǎng)基800 μ 1，在28°C下，150~ 180rpm振蕩培養(yǎng)3~5h ;4000rpm離心2~4min。最后，棄去800 μ 1上清液，剩余的懸浮 菌體涂于含l〇mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上，26~30°C培養(yǎng)1-2天 直到形成單菌落，獲得重組農(nóng)桿菌。