r>[0033] pcambia-1300-GFP載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞驗(yàn)證結(jié)果：對(duì)轉(zhuǎn)化后的重 組農(nóng)桿菌提取質(zhì)粒，并經(jīng)過(guò)1. 5%瓊脂糖電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1，其中，Ml代表DL2000 DNA梯度； M2代表λ噬菌體DNA經(jīng)Hind III完全酶切后產(chǎn)物?？梢?jiàn)有明顯的質(zhì)粒條帶，分子量大小 約為9k，與該雙元載體的大小一致。采用所述雙元質(zhì)粒載體的特異引物"上下游引物（GFP forward-GFP reverse) "擴(kuò)增，隨機(jī)挑選2個(gè)農(nóng)桿菌EHA105單菌落為模板進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒 定，產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖電泳，結(jié)果見(jiàn)圖2。可見(jiàn)2個(gè)樣品均有長(zhǎng)度約為750bp的目的條帶， 跟預(yù)期相符合。說(shuō)明成功地將雙元質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，得到了重組農(nóng)桿菌。
[0034] (2)農(nóng)桿菌重懸液的制備：挑取重組農(nóng)桿菌單菌落在YEB固體培養(yǎng)基（pH7. 2)上 活化2次?；罨瓿珊笤俳臃N單菌落到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中，在26~28°C培養(yǎng)12~16h。然 后按照體積比為1:100 (即重組農(nóng)桿菌菌液：YEB液體培養(yǎng)基）將所述重組農(nóng)桿菌菌液接種 于含有50mg/L卡那霉素，10mg/L利福平和20mg/L乙酰丁香酮的YEB液體培養(yǎng)基中，形成接 種液，于26~30°C振搖至使所述接種液在波長(zhǎng)為600nm的吸光度值為1.0 ;最后將所述接 種液重懸于含3%蔗糖，20mg/L乙酰丁香酮和0. 6M甘露醇的1/2MS固體培養(yǎng)基中，得到農(nóng) 桿菌重懸液。
[0035] 步驟二：雙元質(zhì)粒在浮萍組織中的轉(zhuǎn)化與表達(dá)。
[0036] (1)為了獲得浮萍生長(zhǎng)的最佳狀態(tài)，該步驟中還包括對(duì)浮萍進(jìn)行預(yù)
[0037] 處理，即對(duì)待轉(zhuǎn)化浮萍組織（主要是葉狀體和分生組織，其中包括愈傷
[0038] 組織）的培養(yǎng)，包括如下流程：
[0039] 浮萍葉狀體預(yù)培養(yǎng)：20~25°C下，葉狀體在含1 %蔗糖和10 μ M吲哚乙酸的SH培 養(yǎng)基中培養(yǎng)，在光生物反應(yīng)器中16h光照/8h黑暗，40 μ mol/m2 · sec預(yù)培養(yǎng)2周。
[0040] (2)為了在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中分析不同濃度抗生素、植物激素對(duì)經(jīng)過(guò)外源基因轉(zhuǎn)化的浮 萍其再生能力與狀況，本發(fā)明中還設(shè)計(jì)了正交實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)最適條件篩選流程。
[0041] 設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)采用的為浮萍葉狀體，抗生素為潮霉素水溶液，濃度分別為0、5、10、 20和40mg/L ;植物激素包括6-芐基嘌呤、萘乙酸水溶液，濃度分別各為0、0. 5、1、2和5mg/ L。每個(gè)濃度處理組含10個(gè)浮萍葉狀體，重復(fù)3次，如表1所示。
[0042] 表1.正交分析植物激素和抗生素對(duì)浮萍葉狀體再生的影響
[0043]
備注：所述K值表不任意列上水平號(hào)為i時(shí)所對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和的平均值（Ki(第m列） =第m列中數(shù)字與"i"對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和的平均值。即，表1中的&、K2、K3、K4、K 5 代表6-芐基嘌呤、萘乙酸或潮霉素分別在5組濃度下對(duì)應(yīng)的再生葉狀體的葉片數(shù)目平均值， "C)"內(nèi)的數(shù)值代表當(dāng)前統(tǒng)計(jì)的K值其所對(duì)應(yīng)的6-芐基嘌呤、萘乙酸或潮霉素的濃度。所 述極差值，為同一列的&、K2、K3、IQ、K5中的最大值與最小值之差。_
[0044] 根據(jù)表1以及圖3結(jié)果分析，每個(gè)濃度的各個(gè)葉狀體再生后生成的葉狀體數(shù)統(tǒng)計(jì) 分析來(lái)看，極差值表明三種影響因素中，萘乙酸的濃度對(duì)浮萍生長(zhǎng)影響最大，其次是潮霉素 和6-芐基嘌呤。其中實(shí)驗(yàn)組6的條件，相對(duì)應(yīng)為0. 5mg/L 6-芐基嘌呤、Omg/L萘乙酸、5mg/ L潮霉素對(duì)于浮萍葉狀體再生是最適條件。為了提高抗生素對(duì)浮萍葉狀體轉(zhuǎn)化后的選擇性， 又進(jìn)行了抗生素植物毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明20mg/L潮霉素對(duì)于浮萍葉狀體再生篩選是最適 的條件。
[0045] 圖3是不同濃度抗生素、植物激素實(shí)驗(yàn)組葉狀體再生后葉狀體片數(shù)。本發(fā)明將單 個(gè)浮萍葉狀體再生后生成的葉狀體群體稱為一簇，每個(gè)濃度做了 10個(gè)單一葉狀體，相當(dāng)于 每個(gè)濃度有10簇葉狀體群體。貝IJ :
[0046] 柱狀區(qū)域一一表示將每個(gè)濃度組10個(gè)葉狀體生成的葉狀體片數(shù)/10所得的數(shù)值， 即，每簇的平均葉狀體片數(shù)；
[0047] 黑色豎線一一代表標(biāo)準(zhǔn)差；★代表實(shí)驗(yàn)組6與其他實(shí)驗(yàn)組比較P〈0. 01 (P代表結(jié)果 可信程度指標(biāo)，值越大，結(jié)果可信度越低）。黑色豎線越短說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)組以內(nèi)的各對(duì)象所得 數(shù)值越接近。
[0048] (3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化浮萍組織及共培養(yǎng)：
[0049] 將預(yù)培養(yǎng)的葉狀體上用無(wú)菌解剖刀在分生組織區(qū)域割劃若干處，然后在農(nóng)桿菌重 懸液（lX10 8cfu/ml~lX109cfu/ml)中浸泡10_15min左右。然后在無(wú)菌濾紙上吸干菌 液，移植入鋪有無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)基（含3%蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮、0. 5mg/L 6-芐基嘌 呤的1/2MS固體培養(yǎng)基）中，23°C，避光培養(yǎng)3天。此時(shí)，完成雙元質(zhì)粒至浮萍葉狀體上的 轉(zhuǎn)化與瞬時(shí)表達(dá)。
[0050] 此時(shí)，可以將完成雙元質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與表達(dá)的浮萍葉狀體進(jìn)行報(bào)告基因的表達(dá)檢測(cè)。 由于pcambia-1300-GFP載體含有GFP基因，能夠產(chǎn)生綠色熒光蛋白，因此通過(guò)熒光顯微鏡 觀察轉(zhuǎn)化后的浮萍植株來(lái)進(jìn)行篩選。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株經(jīng)藍(lán)色激發(fā)光照射能夠發(fā)出綠色熒光， 可以用于綠色熒光蛋白檢測(cè)和定位。
[0051] 見(jiàn)圖4所示，在熒光顯微鏡下，采用藍(lán)色激發(fā)光，圖4A所示，暗視野下，可見(jiàn)葉片中 有大量顆粒狀的熒光點(diǎn)，表明外源的GFP基因在浮萍中大量表達(dá)；結(jié)合圖4B所示，明視野 下，浮萍葉片上的氣孔清晰可見(jiàn)，熒光蛋白所發(fā)出的綠色熒光被白光掩蓋?？梢钥吹疥?yáng)性浮 萍植株葉片和新生芽上具有綠色熒光蛋白表達(dá)。表明外源蛋白成功的在浮萍中得到表達(dá)。 在25個(gè)轉(zhuǎn)化浮萍葉狀體中有23個(gè)葉狀體有綠色熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到92%。
[0052] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬技術(shù) 領(lǐng)域中具有同等知識(shí)者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許變更和潤(rùn)飾，因此本 發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種外源基因轉(zhuǎn)化浮萍并進(jìn)行表達(dá)的方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一：將外源基因轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，獲得重組農(nóng)桿菌；然后配制農(nóng)桿菌重懸液； 步驟二：在所述浮萍葉狀體區(qū)域割劃若干處，然后將所述割劃后的浮萍葉狀體在所述 農(nóng)桿菌重懸液中浸泡l〇-15min，通過(guò)所述重組農(nóng)桿菌將所述外源基因生長(zhǎng)到所述浮萍葉狀 體中；然后將所述浮萍葉狀體移植入鋪有無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)基中，室溫下避光培養(yǎng)3天以 上。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌重懸液的配制步驟為：挑 取重組農(nóng)桿菌單菌落在YEB固體培養(yǎng)基上活化；活化完成后的重組農(nóng)桿菌單菌落再接種到 YEB液體培養(yǎng)基中，26~30°C生長(zhǎng)過(guò)夜，獲得重組農(nóng)桿菌菌液；然后按照體積比為1:50~ 100將所述重組農(nóng)桿菌菌液接種于含有50mg/L卡那霉素，10mg/L利福平和20mg/L乙酰丁 香酮的YEB液體培養(yǎng)基中形成接種液，于26~30 °C振搖至使所述接種液在波長(zhǎng)為600nm的 吸光度值為1. 〇 ;最后將所述接種液重懸于含3 %鹿糖，20mg/L乙酰丁香酮和0. 6M甘露醇 的1/2MS固體培養(yǎng)基中，得到農(nóng)桿菌重懸液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述步驟二還包括對(duì)浮萍的預(yù)處理： 在SH培養(yǎng)基含1 %蔗糖和10yM吲哚乙酸中于20~25°C，在光生物反應(yīng)器中16h光照/8h 黑暗，40ymol/m2 ?sec預(yù)培養(yǎng)2周以上。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于，還包括一正交試驗(yàn)，即選用抗生素水 溶液，濃度分別為〇、5、10、20和40mg/L;每個(gè)濃度處理若干組浮萍葉狀體，重復(fù)若干次；植 物激素水溶液，濃度分別各為〇、〇. 5、1、2和5mg/L;每個(gè)濃度處理若干組浮萍葉狀體，重復(fù) 若干次，通過(guò)分析極差值找出未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的浮萍在抗生素、植物激素影響下的最佳生長(zhǎng)條 件。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌重懸液中所述 重組農(nóng)桿菌的濃度為lX108cfu/ml~lX109cfu/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述外源基因?yàn)?pcambia-1300-GFP雙元質(zhì)粒；所述農(nóng)桿菌為EHA105。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種將外源基因快速高效轉(zhuǎn)化入浮萍并進(jìn)行表達(dá)的方法。步驟一：將外源基因轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，獲得重組農(nóng)桿菌；然后配制農(nóng)桿菌重懸液；步驟二：在所述浮萍葉狀體割劃若干處，然后將所述割劃后的浮萍葉狀體在所述農(nóng)桿菌重懸液中浸泡10-15min，通過(guò)所述重組農(nóng)桿菌將所述外源基因轉(zhuǎn)化到所述浮萍葉狀體中；然后將所述浮萍葉狀體移植入鋪有無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)基中，室溫下避光培養(yǎng)3天以上。最后進(jìn)行選擇性篩選。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法操作方便，轉(zhuǎn)化效率高，大大簡(jiǎn)化了將外源基因轉(zhuǎn)化到宿主植株浮萍的操作，轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率大大提高。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/84
【公開(kāi)號(hào)】CN104894162
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510349395
【發(fā)明人】呂建華, 薛智權(quán), 唐杰, 馬炯
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)深圳研究生院
【公開(kāi)日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年6月23日