一種培育轉(zhuǎn)基因高銅積累植物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種培育轉(zhuǎn)基因高銅積累及強(qiáng)銅抗性植物的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類文明高度發(fā)展的今天，環(huán)境問(wèn)題越來(lái)越受到人們的關(guān)注，其中重金屬引起的 土壤污染也日益成為科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。土壤被重金屬污染后，不僅直接影響作物 產(chǎn)量和品質(zhì)，還會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重影響人體健康和安全。
[0003] 隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，銅已經(jīng)成為了我國(guó)重金屬污染土壤中主要的污染元素之 一。環(huán)境中的銅主要來(lái)源于兩個(gè)方面，一是自然本身，二是人類活動(dòng)。地殼運(yùn)動(dòng)、火山噴發(fā)以 及巖石風(fēng)化等自然活動(dòng)使大量的銅進(jìn)入土壤和水體環(huán)境中，成為可被生物利用的形式。人 類活動(dòng)主要包括銅礦的大規(guī)模開(kāi)采、冶煉產(chǎn)生的工業(yè)"三廢"，含銅農(nóng)藥和化肥的過(guò)量使用 以及城市生活垃圾的不當(dāng)處理等。銅礦蘊(yùn)藏豐富，人類開(kāi)采銅礦的歷史悠久，并且銅的化學(xué) 性質(zhì)不活潑，被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代工業(yè)，制造業(yè)和生活的許多方面。銅礦在開(kāi)采和冶煉過(guò)程中 會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)氐耐寥篮退w造成嚴(yán)重的污染。
[0004] 在清除銅污染的實(shí)踐中，傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法主要是通過(guò)土壤本身的物理化學(xué)性 質(zhì)，通過(guò)電動(dòng)修復(fù)、改土法、淋洗法等清除土壤中的銅，或者向土壤中投入改良劑如羥基磷 灰石等來(lái)降低土壤中的有效銅含量。這些方法有的費(fèi)用高，易破壞土壤結(jié)構(gòu)，不易操作，沒(méi) 有從根本上將銅從被污染環(huán)境中清除。這些缺點(diǎn)阻礙了上述方法的大規(guī)模應(yīng)用。
[0005] 與傳統(tǒng)的環(huán)境修復(fù)技術(shù)相比，植物修復(fù)具有成本低，環(huán)境友好，效果永久，一般無(wú) 二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是從根本上解決重金屬污染問(wèn)題的重要手段。近年來(lái)，植物修復(fù)技術(shù)以其 自身的優(yōu)勢(shì)成為重金屬污染修復(fù)的研究熱點(diǎn)，但其實(shí)施依賴于理想的超富集植物。通過(guò)基 因工程等技術(shù)發(fā)現(xiàn)和鑒定超富集相關(guān)基因并研發(fā)新型超富集植物是植物修復(fù)技術(shù)發(fā)展的 關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種來(lái)自大腸桿菌的CusF蛋白，或其融合蛋白的新 用途。
[0007] 本發(fā)明所提供的新用途，具體為蛋白質(zhì)、所述蛋白質(zhì)的編碼基因，或含有所述編碼 基因的重組載體在如下al) _a4)任一中的應(yīng)用：
[0008] al)調(diào)控植物的抗銅性；a2)調(diào)控植物對(duì)銅的積累；a3)選育抗銅性增強(qiáng)的植物品 種；a4)選育對(duì)銅的積累量增高的植物品種；
[0009] 所述蛋白質(zhì)為如下（I) - (IV)中任一種：
[0010] (I)由序列表中序列1或序列1的第22-110位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (11) 由序列表中序列2或序列2的第1-113位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（III)由 序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（IV)由序列表中序列4所示的氨基酸序 列組成的蛋白質(zhì)，或由序列4缺失第116-354位后所形成的蛋白質(zhì)。
[0011] 其中，由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)命名為CusF前體蛋白， 序列1的第1-21位為信號(hào)肽序列，第22-110位為CusF成熟蛋白的序列。由序列表中序列 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)命名為SP-CusF-GFP蛋白，序列2的第1-24位為菜豆素 信號(hào)肽（SP)的序列，第25-113位為CusF成熟蛋白的序列，第116-354位為GFP蛋白的序 列。由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)命名為GFP-CusF蛋白，序列3的第 1-239位為GFP的序列，第242-330位為CusF成熟蛋白的序列。由序列表中序列4所示的 氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)命名為SP-CusF-GFP-AFVY蛋白，序列4的第1-24位為菜豆素信 號(hào)肽（SP)的序列，第25-113位為CusF成熟蛋白的序列，第116-354位為GFP蛋白的序列， 第355-358位為液泡分選序列AFVY。
[0012] 在本發(fā)明中，以上al)中的所述調(diào)控植物的抗銅性具體體現(xiàn)在：促進(jìn)所述蛋白質(zhì) 或其編碼基因的表達(dá)，則所述植物的抗銅性增強(qiáng)。以上a2)中的所述調(diào)控植物對(duì)銅的積累具 體體現(xiàn)在：促進(jìn)所述蛋白質(zhì)或其編碼基因的表達(dá)，則所述植物調(diào)控植物對(duì)銅的積累量增高。 以上a3)中的所述選育抗銅性增強(qiáng)的植物品種的方法，以及以上a4)中的所述選育對(duì)銅的 積累量增高的植物品種的方法，均具體可包括將所述蛋白質(zhì)或其編碼基因的表達(dá)量較高的 植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。
[0013] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種培育抗銅性增強(qiáng)和/或?qū)︺~的積累量增高的轉(zhuǎn) 基因植物的方法。
[0014] 本發(fā)明所提供的培育抗銅性增強(qiáng)和/或?qū)︺~的積累量增高的轉(zhuǎn)基因植物的方法， 包括如下步驟：
[0015] a)向目的植物中導(dǎo)入蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物； [0016] b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，抗銅性增強(qiáng)和/或?qū)︺~ 的積累量增高的轉(zhuǎn)基因植物；
[0017] 所述蛋白質(zhì)為如下（I) - (IV)中任一種：
[0018] (I)由序列表中序列1或序列1的第22-110位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (II)由序列表中序列2或序列2的第1-113位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（III)由 序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（IV)由序列表中序列4所示的氨基酸序 列組成的蛋白質(zhì)，或由序列4缺失第116-354位后所形成的蛋白質(zhì)。
[0019] 在上述的應(yīng)用或方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因，是如下1)至6)中任一所述的 DNA分子：
[0020] 1)序列表中序列5或序列5的第64-333位所示的DNA分子；2)序列表中序列6 或序列6的第1-339位所不的DNA分子；3)序列表中序列7所不的DNA分子；4)序列表中 序列8所示的DNA分子，或由序列8缺失第346-1062位后所形成的DNA分子。5)在嚴(yán)格條 件下與1) -4)任一限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；6)與1) -5)任一 限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0021] 上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0· 1%SDS 和 I X SSC，(λ 1%SDS 各洗膜一次。
[0022] 其中，序列5由333個(gè)核苷酸組成，編碼所述CusF前體蛋白，序列5的第1-63位編 碼信號(hào)肽，第64-333位為所述CusF成熟蛋白的編碼序列。序列6由1065個(gè)核苷酸組成，編 碼所述SP-CusF-GFP蛋白，序列6的第1-72位編碼所述菜豆素信號(hào)肽（SP)，第73-339位為 所述CusF成熟蛋白的編碼序列，第346-1065位為所述GFP蛋白的編碼序列。序列7由993 個(gè)核苷酸組成，編碼所述GFP-CusF蛋白，序列7的第1-717位為所述GFP蛋白的編碼序列， 第724-993位為所述CusF成熟蛋白的編碼序列。序列8由1077個(gè)核苷酸組成，編碼所述 SP-CusF-GFP-AFVY蛋白，序列8的第1-72位編碼所述菜豆素信號(hào)肽（SP)，第73-339位為 所述CusF成熟蛋白的編碼序列，第346-1062位為所述GFP蛋白的編碼序列，第1063-1077 位為所述液泡分選序列AFVY的編碼序列。
[0023] 在所述方法中，所述編碼基因是通過(guò)含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體 導(dǎo)入所述目的植物中的。
[0024] 所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng) 桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如PCAMBIA3301、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、 pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pWM101、pGreen0029、pBI121、pBinl9、pCAMBIA1301-UbiN 等或 其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含 聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引 導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始 核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病 毒（CAMV) 35S啟動(dòng)子、泛素基因 Ubiquitin啟動(dòng)子（pUbi)、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A等，它 們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載 體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密 碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確 翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。 翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行 鑒定及篩選，可對(duì)所用重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色 變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也 可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0025] 在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng) 子，具體為花椰菜花葉病毒（CAMV) 35S啟動(dòng)子。
[0026] 更為具體的，所述重組表達(dá)載體為將所述編碼基因插入到PCAMBIA1301-N-GFP載 體或PCAMBIA2300-C-GFP載體的多克隆位點(diǎn)后得到的重組質(zhì)粒。在該重組表達(dá)載體中，啟 動(dòng)所述編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為所述花椰菜花葉病毒（CAMV) 35S啟動(dòng)子。
[0027] 在上述方法的步驟a)中，所述"向目的植物中導(dǎo)入蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達(dá)所 述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物"，其中，所述編碼基因可為特異性表達(dá)于所述轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞 壁、液泡或細(xì)胞質(zhì)。
[0028] 在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體具體為如下中的任一個(gè)：
[0029] (al)將序列6的第1-339位所示的DNA片段插入到pCAMBIA1301-N-GFP載體的酶 切位點(diǎn)Xba I和Kpn I之間后得到的重組質(zhì)粒(命名為CusFew-GFP,細(xì)胞壁特異性表達(dá))。
[0030] (a2)將序列7的第724-993位所示的DNA片段插入到pCAMBIA2300-C-GFP載體 的酶切位點(diǎn)BamHI和Pst I之間后得到的重組質(zhì)粒(命名為GFP-CusFeyt。，細(xì)胞質(zhì)特異性表 達(dá))。
[0031] (a3)將序列8的第346-1077位所示的DNA片段插入到所述CusFew-GFP載體的酶 切位點(diǎn)Kpn I和Sac I之間后得到的重組質(zhì)粒(命名為CusFvac;-GFP，液泡特異性表達(dá))。
[0032] 其中，所述pCAMBIA1301-N-GFP載體按照如下方法制備得到：用Hind III和EcoRI 雙酶切P221-GFP載體，回收大小為1460bp的目的條帶(含GFP的表達(dá)框)，將其與經(jīng)過(guò)同樣 雙酶切的PCAMBIA1301載體的骨架片段相連，得到的重組載體即為pCAMBIA1301-N-GFP載 體。
[0033] 所述PCAMBIA2300-C-GFP載體按照如下方法制備得到：以p221-GFP載體為模板， 用引物2300-GFP-F和引物2300-GFP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Kpn I和BamH I進(jìn)行雙酶切，回收大小為1460bp的目的條帶(含GFP的表達(dá)框)，將其與經(jīng)過(guò)同 樣雙酶切的PCAMBIA2300載體的骨架片段相連，得到的重組載體即為pCAMBIA2300-C-GFP 載體。
[0034] 2300-GFP-F :5, -TAggtaccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA~3,；
[0035] 2300-GFP-R : 5 ' -GCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'。
[0036] 在上述方法中，將攜帶有所述編碼基因的所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物， 具體可為：通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法、花粉管導(dǎo)入法、脂質(zhì)體融合法以及其他任 意可將質(zhì)粒導(dǎo)入的方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織