（SP ) (序列4的第1-24位)，第73-339位編碼CusF成熟蛋白（序列4的第25-113位)，第346-1062 位編碼GFP蛋白（序列4的第116-354位)，第1063-1077位編碼液泡分選序列AFVY (序列 4的第355-358位)。其中GFP蛋白的編碼序列為pCAMBIA1301-N-GFP載體上自帶序列。
[0254] 在重組表達(dá)載體CusFvae-GFP中，啟動序列8所示DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動子為 CaMV35S啟動子。
[0255] 二、用重組表達(dá)載體CusFvae-GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101
[0256] 參照實施例1進(jìn)行。
[0257] 三、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得
[0258] 參照實施例1進(jìn)行。獲得Tl代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。
[0259] 采用同樣的方法，用 GV3101/pCAMBIA1301-N-GFP 侵染擬南芥（Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型中，得到轉(zhuǎn)空載體擬南芥，作為對照。
[0260] 四、CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因植株的DNA水平鑒定
[0261] 取步驟三Tl代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片，用Edwards方法提取轉(zhuǎn)基因株 系的DNA，進(jìn)行PCR鑒定。同時以未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型）和轉(zhuǎn)入 PCAMBIA1301-N-GFP空載體的擬南芥植株作為對照。具體操作參見實施例1。
[0262] 結(jié)果如圖12所示，T1代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中均擴增得到大小 約為640bp的目的條帶，而在未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型）和轉(zhuǎn)入 PCAMBIA1301-N-GFP空載體的擬南芥中沒有，說明得到目的條帶的株系均為陽性的 CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因株系。
[0263] 五、CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)錄水平鑒定
[0264] 收取步驟四中鑒定為陽性的種子，得到T2代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中，篩 選出分離比符合3:1 (后代潮霉素抗性苗和非抗性苗比例為3:1)的株系，取其中4個分別 記為L1、L2、L3和L4。提取各株系的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR檢測轉(zhuǎn)化結(jié)果。同時以未轉(zhuǎn) 基因的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)和轉(zhuǎn)入PCAMBIA1301-N-GFP空載體的擬南芥植株作 為對照。具體操作參見實施例1。
[0265] 結(jié)果如圖13所示，4個T2代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥株系LI、L2、L3和L4中高 表達(dá)CusF基因。而轉(zhuǎn)空載體擬南芥植株與未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥相一致，均無 CusF基 因表達(dá)。
[0266] 六、CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因植株的蛋白水平鑒定
[0267] 從T2代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥株系Ll和L3中提取蛋白樣品，用Western印跡 法檢測CusF蛋白的表達(dá)結(jié)果。同時以未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型）和轉(zhuǎn)入 PCAMBIA1301-N-GFP空載體的擬南芥植株作為對照。具體操作參見實施例1。
[0268] 結(jié)果顯示，GFP抗體在CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥中檢測出39kD的條帶，正好是 SP-CusF-GFP-AFVY融合蛋白的大小，表明SP-CusF-GFP-AFVY融合蛋白在擬南芥中以正確 的分子量成功表達(dá)。而轉(zhuǎn)空載體擬南芥植株與未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型） 相一致，均無目的蛋白的表達(dá)。部分植株檢測結(jié)果見圖14。
[0269] 七、CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因植株中SP-CusF-GFP-AFVY融合蛋白的亞細(xì)胞定位分析
[0270] 以4個T2代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥株系LI、L2、L3和L4為實驗材料，進(jìn)行 SP-CusF-GFP-AFVY融合蛋白的亞細(xì)胞定位分析。具體操作如下：種子經(jīng)表面消毒后，鋪在 1/2MS固體培養(yǎng)基平板上，生長三天后，用激光共聚焦顯微鏡觀察Leica TCS SP5觀察GFP 熒光。用60倍水鏡觀察，GFP的激發(fā)波長設(shè)置為488nm，接收光譜范圍為500-530nm。
[0271] 結(jié)果如圖4所示，可見CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因植株中SP-CusF-GFP-AFVY融合蛋白確 實定位于液泡，與預(yù)期結(jié)果一致。
[0272] 八、CusFvac-GFP轉(zhuǎn)基因植株銅積累的鑒定
[0273] 將4個T2代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥株系LI、L2、L3和L4種子用潮霉素篩選， 每株系移16株潮霉素抗性苗到土中繼續(xù)生長，收取T3代種子，從T3代中篩出純合體用于 如下抗性和積累實驗。
[0274] 供試材料：4個T3代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥株系L1、L2、L3和L4純合體，以及 未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)和轉(zhuǎn)入PCAMBIA1301-N-GFP空載體的擬南芥植 株。實驗中，每個擬南介株系均保證樣本量在15株以上。
[0275] 實驗方法同實施例1。
[0276] 結(jié)果如圖15所示，用學(xué)生t檢驗的方法在p〈0. 05和p〈0. 01水平上對各轉(zhuǎn)基因株 系與WT之間差異的顯著性進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示4個T3代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥株系 LI、L2、L3和L4純合體中銅離子積累量明顯高于未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài) 型)植株。而轉(zhuǎn)入PCAMBIA1301-N-GFP空載體的擬南芥植株與未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥(哥 倫比亞生態(tài)型）植株相比基本一致，無統(tǒng)計學(xué)意義。
[0277] 九、CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因植物的抗銅性鑒定
[0278] 供試材料：4個T3代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥株系L1、L2、L3和L4純合體，以及 未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)和轉(zhuǎn)入PCAMBIA1301-N-GFP空載體的擬南芥植 株。實驗中，每個擬南介株系均保證樣本量在30株以上。
[0279] 實驗方法同實施例1。
[0280] 結(jié)果如圖16所示，4個T3代CusFvae-GFP轉(zhuǎn)基因株系LI、L2、L3和L4純合體的主根 的長度比野生型植株長，具有顯著差異。而轉(zhuǎn)入PCAMBIA1301-N-GFP空載體的擬南芥植株 與未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型）植株相比基本一致，無統(tǒng)計學(xué)意義（圖17)。
【主權(quán)項】
1. 蛋白質(zhì)在如下al)-a4)任一中的應(yīng)用： al)調(diào)控植物的抗銅性； a2)調(diào)控植物對銅的積累； a3)選育抗銅性增強的植物品種； a4)選育對銅的積累量增高的植物品種； 所述蛋白質(zhì)為如下（I) - (IV)中任一種： (I) 由序列表中序列1或序列1的第22-110位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (II) 由序列表中序列2或序列2的第1-113位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (III) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (IV) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或由序列4缺失第116-354 位后所形成的蛋白質(zhì)。2. 蛋白質(zhì)的編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在如下al)_a4)任一中的應(yīng)用： al)調(diào)控植物的抗銅性； a2)調(diào)控植物對銅的積累； a3)選育抗銅性增強的植物品種； a4)選育對銅的積累量增高的植物品種； 所述蛋白質(zhì)為如下（I) - (IV)中任一種： (I) 由序列表中序列1或序列1的第22-110位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (II) 由序列表中序列2或序列2的第1-113位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (III) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (IV) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或由序列4缺失第116-354 位后所形成的蛋白質(zhì)。3. 培育抗銅性增強和/或?qū)︺~的積累量增高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟： a) 向目的植物中導(dǎo)入蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物； b) 從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，抗銅性增強和/或?qū)︺~的積 累量增高的轉(zhuǎn)基因植物； 所述蛋白質(zhì)為如下（I) - (IV)中任一種： (I) 由序列表中序列1或序列1的第22-110位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (II) 由序列表中序列2或序列2的第1-113位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (III) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (IV) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或由序列4缺失第116-354 位后所形成的蛋白質(zhì)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述蛋白 質(zhì)的編碼基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子： 1) 序列表中序列5或序列5的第64-333位所示的DNA分子； 2) 序列表中序列6或序列6的第1-339位所示的DNA分子； 3) 序列表中序列7所示的DNA分子； 4) 序列表中序列8所示的DNA分子，或由序列8缺失第346-1062位后所形成的DNA分 子。 5) 在嚴(yán)格條件下與I) -4)任一限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 6) 與1)-5)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述編碼基因是通過含有所述蛋白 質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中的。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述重組表達(dá)載體中啟動所述編碼基因 轉(zhuǎn)錄的啟動子為35S啟動子。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于：所述植物為單子葉植物 或雙子葉植物。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用或方法，其特征在于：所述雙子葉植物為擬南芥。9. 如下（A)或（B)的生物材料： (A) 蛋白質(zhì)，為如下（a) - (c)中任一種： (a) 由序列表中序列2或序列2的第1-113位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (c )由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或由序列4缺失第116-354位 后所形成的蛋白質(zhì)； (B) 編碼（A)中所述蛋白質(zhì)的核酸分子； 所述核酸分子具體是編碼所述蛋白質(zhì)的基因；所述基因具體是如下（d)至（h)中任一 所述的DNA分子： (d) 序列表中序列6或序列6的第1-339位所示的DNA分子； (e) 序列表中序列7所示的DNA分子； (f) 序列表中序列8所示的DNA分子，或由序列8缺失第346-1062位后所形成的DNA 分子； (g) 在嚴(yán)格條件下與（d) - (f)任一限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分 子； (h) 與（d)_ (g)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分 子。10. 含有權(quán)利要求9中所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種培育轉(zhuǎn)基因高銅積累植物的方法。本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用：a1）調(diào)控植物的抗銅性；a2）調(diào)控植物對銅的積累；a3）選育抗銅性增強的植物品種；a4）選育對銅的積累量增高的植物品種；所述蛋白質(zhì)為由序列表中序列1-序列4中任一所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明通過基因工程技術(shù)將所述蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)移到擬南芥中，使其在植物細(xì)胞的細(xì)胞壁/細(xì)胞質(zhì)/液泡中特異表達(dá)，可以顯著提高擬南芥對重金屬銅的積累能力（Cu積累量可提高2倍），且其Cu耐受性明顯增強；本發(fā)明具有廣泛的實用性，可實現(xiàn)在重金屬污染的土壤上種植植物既能耐受重金屬脅迫又能富集重金屬離子，以獲得新型的用于植物修復(fù)的植物品種。
【IPC分類】C12N15/62, C12N15/82, A01H5/00, C12N15/31, C07K14/245, C12N5/10, C07K19/00, C12N1/21
【公開號】CN104974232
【申請?zhí)枴緾N201410138373
【發(fā)明人】張海燕, 余朋麗, 袁金紅
【申請人】中國科學(xué)院植物研究所
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2014年4月8日