與cd34分子特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別設(shè)及能與CD34分子特異性結(jié)合的多膚及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] CD34分子是一種高度糖基化的I型跨膜蛋白，分子量在105~120kD，結(jié)構(gòu)上 具有獨(dú)特性，特異性的表達(dá)于人類及其他哺乳動物造血干/祖細(xì)胞化emopoieticstem/ progenitorcell,服C/HPC)表面，并隨著造血細(xì)胞逐漸成熟，CD34的表達(dá)量逐漸減少，直至 消失。其次，CD34分子還表達(dá)于正常及腫瘤的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，其在血管內(nèi)皮中的作用 機(jī)制尚不明確。
[0003] 已有的研究結(jié)果表明CD34分子在介導(dǎo)細(xì)胞間黏附作用中發(fā)揮著重要作用，參與 服C/HPC造血干細(xì)胞的運(yùn)輸、定位和歸巢CD34單克隆抗體與CD34分子的胞外域結(jié)合后可上 調(diào)細(xì)胞CD34分子與骨髓間質(zhì)層的結(jié)合。在HSC/HPC歸巢中，細(xì)胞表面的CD34分子首先和 內(nèi)皮細(xì)胞及骨髓基質(zhì)的L選擇素結(jié)合啟動黏附，然后穿越內(nèi)皮細(xì)胞層，定位于骨髓血管外 基質(zhì)，增殖分化，完成歸巢過程。CD34介導(dǎo)的黏附信號通過酪氨酸蛋白激酶信號通路調(diào)節(jié) CXCR4等G蛋白偶聯(lián)受體表達(dá)，促使細(xì)胞發(fā)生趨化、黏附和遷移。酪氨酸蛋白激酶抑制劑和 CXCR4阻斷劑可抑制細(xì)胞黏附，動員服C/HPC到外周血循環(huán)。
[0004] 服C/HPC黏附作用的調(diào)節(jié)藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于骨髓抑制的修復(fù)。在服C/HPC移 植治療過程中，首先應(yīng)用服C/HPC動員藥物，抑制細(xì)胞黏附作用，使服C/HPC易于穿過髓血 屏障，進(jìn)入外周血循環(huán)，W便于HSC/HPC的富集和采??；在移植后，應(yīng)用HSC/HPC黏附促進(jìn) 藥物，提高CD34黏附作用，增強(qiáng)CD34分子與骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面分子的結(jié)合，促進(jìn)HSC/HPC 的定植，歸巢和造血及免疫功能的恢復(fù)重建。 陽0化]臨床上還利用服C/HPC動員藥物等抑制細(xì)胞黏附作用，使服C/HPC進(jìn)入外周血循 環(huán)，修復(fù)治療組織損傷如屯、腦梗塞等。
[0006] 在臨床應(yīng)用中，CD34分子的檢測可用于服C/HPC的確認(rèn)、計(jì)數(shù)、富集和純化，在 服C移植W及腫瘤生物治療中具有重要意義。利用CD34純化服C/HPC可減少異基因造血 干細(xì)胞移植時(shí)移植物中的T細(xì)胞，從而有效減少由于T細(xì)胞引起的急慢性移植物抗宿主疾 ?。╣raft-vs-hostdisease，GVHD)的發(fā)生；CD34分子可W用于白血病的診斷及分型，CD34 分子特異性的表達(dá)于某些未分化或低分化的白血病細(xì)胞，并且在急性髓系白血?。╝cute myeloidleukemia,AML)細(xì)胞上的表達(dá)差異與臨床化療療效、預(yù)后有一定的相關(guān)性；CD34 分子被認(rèn)為是最敏感的血管內(nèi)皮標(biāo)記物，可用于計(jì)數(shù)微血管，判定腫瘤血管生成狀況W及 腫瘤血管生成抑制劑的療效。
[0007] CD34還參與炎癥反應(yīng)W及淋己細(xì)胞的歸巢，CD34抗體是深入研究CD34分子在造 血、炎癥反應(yīng)和血管新生中的作用機(jī)制，W及HSP/HPC分離純化和急性髓系白血病的診斷 不可缺少的分子探針。至今僅美、英、法、丹麥等極少數(shù)國家研制出10余株鼠源性抗人CD34 抗體，均采用經(jīng)典的雜交瘤技術(shù)。運(yùn)些CD34抗體均特異性的結(jié)合CD34分子，并能識別服C/ HPC、血管內(nèi)皮細(xì)胞及某些白血病細(xì)胞。但CD34抗體在制備和臨床應(yīng)用中仍面臨著一些問 題：首先，由于CD34分子免疫原性很弱，不易刺激機(jī)體產(chǎn)生分泌特異抗體的B細(xì)胞，致使CD34抗體的制備工作量大且成功率低，具有成本高，生產(chǎn)周期長的缺點(diǎn)；其次，在造血干細(xì) 胞移植的過程中，運(yùn)些鼠源性抗體將不可避免地伴隨著造血干細(xì)胞進(jìn)入人體，從而引起人 抗鼠抗體免疫應(yīng)答化umananti-mouseantibodyresponse，KAMA),遺留醫(yī)療安全隱患。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明為彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能與CD34分子特異性結(jié)合的多膚，其具 有易于制備，分子量小，不易產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)等特點(diǎn)。
[0009] 本發(fā)明為達(dá)到其目的，采用的技術(shù)方案如下：提供與CD34分子特異性結(jié)合的多 膚，所述多膚選自17號多膚、19號多膚中的至少一種，所述17號多膚、19號多膚的氨基酸 序列分別如序列表中序列1、序列2所示。
[0010] 本發(fā)明提供的多膚能與CD34分子特異性結(jié)合，可W用人工合成或基因工程的 方法生產(chǎn)。該多膚亦可稱之為一種非抗體結(jié)合蛋白（non-antibodybindingprotein), 非抗體結(jié)合蛋白是相對于抗體/抗原特異性結(jié)合的特征而言，又稱之為支架結(jié)合蛋白 (scaffoldsbindingprotein)。運(yùn)類蛋白在Ξ維結(jié)構(gòu)上通過其表面氨基酸形成的支架能 結(jié)合特定的分子，與抗體比較，具有分子量小，滲透力強(qiáng)，耐熱，穩(wěn)定性好，容易操作和適合 大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)。 陽011] 本發(fā)明提供的多膚能與CD34+造血干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和白血病細(xì)胞（具體如 K562白血病細(xì)胞）結(jié)合，不與CD34-的MNNG/冊S骨肉瘤細(xì)胞結(jié)合。
[0012] 本發(fā)明提供的多膚與CD34+細(xì)胞結(jié)合后不影響細(xì)胞的增殖速率。
[0013] 本發(fā)明提供的多膚可作為CD34陽性表達(dá)細(xì)胞的標(biāo)記物使用，具體如作為導(dǎo)管上 皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物。
[0014] 本發(fā)明提供的多膚還可在干細(xì)胞，特別是服C/HPC細(xì)胞的鑒定、富集、篩選或純化 中應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明提供的多膚還可在制備用于白血病診斷或分型的試劑中應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明提供的多膚還可用于制備CD34祀點(diǎn)藥物，該藥物其活性成分包括上文所 述的多膚。
[0017] 本發(fā)明提供的多膚可用于調(diào)節(jié)CD34陽性細(xì)胞的黏附和歸巢作用，例如可用于制 備具有抑制CD34陽性細(xì)胞的黏附和歸巢作用的藥物制劑。
[0018] 本發(fā)明提供的多膚還可用于制備吸附和富集CD34陽性細(xì)胞的制劑，例如用于組 織再生區(qū)域可吸附造血干細(xì)胞，促進(jìn)組織的再生和愈合；用于白血病患者癌細(xì)胞的初篩。
[0019] 上述利用本發(fā)明的多膚制備藥物或制劑時(shí)，還可W包括藥學(xué)上可接受的載體、輔 料等。運(yùn)些載體或輔料本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所需制備的藥物劑型等要求而具體選擇， 例如載體可W為稀釋劑、賦形劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載 體、潤滑劑中的一種或多種；輔料例如可W包括有香味劑、甜味劑等。藥物劑型例如可W是 膠囊、軟膠囊、片劑、口服液、分散片、凍干粉針、注射液或滴丸等。
[0020] 本發(fā)明提供的多膚還可作為藥物祀向分子使用，其可在制備藥物祀向制劑中應(yīng) 用，例如祀向CD34+細(xì)胞的藥物祀向制劑。
[0021] 本發(fā)明提供的多膚可在分離或檢測CD34陽性細(xì)胞的方法中進(jìn)行應(yīng)用，從而替代 現(xiàn)有技術(shù)中使用CD34抗體來分離或檢測CD34陽性細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明提供的多膚，能夠滿足W下醫(yī)學(xué)應(yīng)用和醫(yī)學(xué)研究的要求： 陽02引 1)可W用于檢、富集和純化服C/HPC;
[0024] 2)可W用于作為血管內(nèi)皮標(biāo)記物； 陽0巧]3)可W用于白血病診斷、分型；
[00%] 4)可W作為藥物祀向分子；
[0027] 5)可W用于作為免疫巧光CD34抗體的代替物；
[002引 6)可W用于抑制CD34陽性細(xì)胞的黏附作用；
[0029] 7)可W用于吸附干細(xì)胞，促進(jìn)組織再生和修復(fù)。
[0030] 另外，本發(fā)明提供的多膚還具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0031] 1)該多膚結(jié)合效率高，可W特異的結(jié)合CD34+干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞 和K562白血病細(xì)胞；
[0032] 2)該多膚毒副作用小，與CD34+細(xì)胞的結(jié)合，對目標(biāo)細(xì)胞沒有明顯的殺傷和抑制 增殖的效果；
[0033] 3)該多膚分子量小，具有通透性好、不易變性、免疫原性低等特點(diǎn)；
[0034] 4)該多膚制備方便，成本低，可用人工合成方法直接合成，也可W通過基因工程的 方法制備，避免了如抗體動物生產(chǎn)的異種蛋白隱患，增進(jìn)了干細(xì)胞分離制備的醫(yī)療安全，有 利于減少干細(xì)胞移植并發(fā)癥。
【附圖說明】 陽03引圖1 :為隧菌體展示技術(shù)篩選到的能與CD34分子結(jié)合的17、1