9和24號(hào)單克隆隧菌 體的PCR結(jié)果。除第一組條帶為Mark夕b從左到右依次為17, 19和24號(hào)隧菌體的PCR條 帶。
[0036] 圖2a-圖化：為將K562白血病細(xì)胞的CD34分子通過CD34抗體免疫共沉淀，然后 與CD34結(jié)合多膚結(jié)合，最后將CD34抗體沉淀后并結(jié)合有CD34巧光多膚的CD34分子通過巧 光分光光度計(jì)檢測(cè)巧光強(qiáng)度的結(jié)果；其中圖2a為17號(hào)多膚與CD34分子結(jié)合的檢測(cè)結(jié)果； 圖化為19號(hào)多膚與CD34分子結(jié)合的檢測(cè)結(jié)果。
[0037] 圖3a-圖3b:為K562白血病細(xì)胞中CD34分子與CD34抗體（紅色巧光）和CD34 結(jié)合多膚（綠色巧光）結(jié)合的免疫巧光照片。其中圖3a為17號(hào)多膚與K562細(xì)胞中CD34 分子結(jié)合的免疫巧光照片（1000X);圖3b為19號(hào)多膚與K562細(xì)胞中CD34分子結(jié)合的免 疫巧光照片（1000X)。 陽(yáng)03引圖4 :CD34結(jié)合多膚對(duì)CD34陽(yáng)性細(xì)胞黏附作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0039] 圖5 :為磁性分離示意圖。
[0040] 圖6a:為CD34結(jié)合多膚與人頌下腺組織切片中導(dǎo)管上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的 巧光顯微鏡照片，圖中綠色巧光為多膚結(jié)合部位，藍(lán)色巧光為DAPI核染色；
[0041] 圖化：為CD34結(jié)合多膚的陰性對(duì)照，藍(lán)色巧光為DAPI核染色；
[0042] 圖6c:為人頌下腺組織切片中CD34表達(dá)的免疫巧光照片，紅色巧光為CD34表達(dá)， 藍(lán)色巧光為DAPI核染色；
[0043] 圖6d:為人頌下腺組織切片的H&E染色結(jié)果。 W44] 圖7a為MNNG/冊(cè)S在明場(chǎng)下的顯微鏡照片；圖化為該區(qū)域細(xì)胞與19號(hào)多膚結(jié)合 的巧光顯微鏡照片。 W45] 圖8a為MNNG/冊(cè)S在明場(chǎng)下的顯微鏡照片；圖8b為該區(qū)域細(xì)胞與17號(hào)多膚結(jié)合 的巧光顯微鏡照片。
[0046] 圖9 :為在K562細(xì)胞的低血清培養(yǎng)液中，分別添加CD34結(jié)合多膚17號(hào)和19號(hào)后， K562細(xì)胞的增殖曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0047]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明：
[0048] 文中的百分比若未特別說明，均為質(zhì)量百分比；文中使用的試劑若未特別說明，均 為可從市面購(gòu)買獲得。 W例實(shí)施例1CD34結(jié)合隧菌體的篩選
[0050] 1)WCD34為祀分子富集結(jié)合CD34的隧菌體 W51] 用5μg/血的CD34分子（購(gòu)自化proTech公司）包被96孔板，利用T7人cDNA文庫(kù)（Novagen)中展示隨機(jī)多膚的T7隧菌體裂解液與3%的脫脂奶粉按質(zhì)量比1:1混合 后，同CD34分子包被的96孔板解育30分鐘。然后用沖洗液洗脫去除非特異性結(jié)合隧菌體， 富集與CD34結(jié)合的T7隧菌體，經(jīng)過反復(fù)篩選，直到隧菌體文庫(kù)回收率不再增加。沒有包被 CD34分子的培養(yǎng)皿作為對(duì)照組。
[0052] 在第一輪篩選中投入的隧菌體滴度為6. 4X101 °C化，回收的隧菌體滴度為 5. 4X105c化，將回收后的隧菌體進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后滴度達(dá)到4. 2X109c化，繼續(xù)投入進(jìn)行第 二輪的篩選，第二輪回收的隧菌體滴度為5. 8X102c化，同樣的將篩選后的隧菌體擴(kuò)增達(dá)到 8. 53X109c化，投入繼續(xù)第Ξ輪篩選，回收到1. 62X104c化，經(jīng)過計(jì)算從第一輪開始篩選回 收率不再增加（表1所示）。將篩選后的隧菌體文庫(kù)保種備用。
[0053] 表1.隧菌體篩選結(jié)果
[0054]
陽(yáng)化日]2)與CD34結(jié)合單克隆隧菌體的篩選 陽(yáng)056] 在富集的隧菌體文庫(kù)中隨機(jī)挑選80個(gè)單克隆隧菌體，經(jīng)擴(kuò)增后，與CD34包被的96 孔板結(jié)合，洗脫去除非特異性結(jié)合的單克隆隧菌體，通過分光光度計(jì)檢測(cè)每個(gè)單克隆隧菌 體的結(jié)合效率。共篩選出3個(gè)與CD34分子結(jié)合率高的單克隆隧菌體，按挑選單克隆順序分 別命名為17、19、24號(hào)單克隆隧菌體。將3個(gè)單克隆隧菌體做菌液PCR，經(jīng)檢測(cè)其結(jié)果如圖 1所示，17、19和24號(hào)隧菌體的菌液PCR條帶均為單一條帶，證明為單克隆隧菌體。
[0057] 3)序列測(cè)序和多膚合成
[0058] 將Ξ個(gè)單克隆隧菌體送廣州艾基生物技術(shù)有限公司，測(cè)序與CD34分子結(jié)合的陽(yáng) 性單克隆隧菌體中插入的cDNA序列，分析得到與CD34分子特異性結(jié)合的氨基酸序列。17 和19號(hào)隧菌體展示的氨基酸序列分別如序列表中序列1、序列2所示，24號(hào)隧菌體展示的 氨基酸序列還在科學(xué)論證中，因而在此不予展示。
[0059] 人工合成17和19號(hào)隧菌體展示的多膚（上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成），分別 命名為17號(hào)多膚、19號(hào)多膚，其氨基酸序列分別如序列表中序列1、序列2所示，并在N末 端添加FITC(綠色巧光）標(biāo)簽，純度> 95%。
[0060] 實(shí)施例2CD34結(jié)合多膚免疫共沉淀
[0061] (1)提取總蛋白：用預(yù)冷的PBS緩沖液洗涂K562細(xì)胞一次，棄去PBS，于培養(yǎng)皿中 加入500μL含蛋白酶抑制劑的非變性蛋白裂解液，將細(xì)胞收集到1. 5mL的離屯、管中，超聲 波破碎4次，每次4秒，冰上放置30分鐘，800化pm4°C離屯、20分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新離 屯、管中，即得細(xì)胞總蛋白產(chǎn)物；
[00創(chuàng) 似細(xì)胞總蛋白產(chǎn)物預(yù)處理：在細(xì)胞總蛋白產(chǎn)物中加入50μL正常山羊血清封閉 液，在冰上解育1小時(shí)，然后加入100μL蛋白G微球懸液（Ca化iochem)，在4°C解育20分 鐘，離屯、去除蛋白G微球；
[0063] (3)免疫共沉淀：向經(jīng)步驟（2)預(yù)處理后的總蛋白中加入CD34抗體（AR)為實(shí)驗(yàn) 組，對(duì)照組則加入等量的PBS抗體稀釋液，4°C解育8小時(shí)； W64] (4)多膚共結(jié)合及蛋白G抗體純化：分別將17號(hào)和19號(hào)多膚加入各自的實(shí)驗(yàn)組 和對(duì)照組，同時(shí)加入蛋白G微球懸液，4°C解育4小時(shí)； 陽(yáng)0化](5)清洗和洗脫，4°C離屯、去除上清，用洗液清洗3次，離屯、去上清，加入與蛋白G微 球體積等量的2XSDS緩沖液，在50°C處理10分鐘，離屯、去除微球，轉(zhuǎn)移上清到新的EP管， 加入DTT(二硫蘇糖醇）到終濃度為lOOmM;
[0066] (5)微量巧光分光光度計(jì)（NanoDrop3300)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的巧光強(qiáng)度。
[0067] 如圖2曰、2b所示（圖2a顯示的是17號(hào)多膚的巧光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果，圖2b顯示的 是19號(hào)多膚巧光光度計(jì)的檢測(cè)結(jié)果），由圖2曰、化可知，通過CD34抗體免疫共沉淀的蛋白 可與17號(hào)和19號(hào)多膚特異性結(jié)合，而且19號(hào)多膚結(jié)合的特異性優(yōu)于17號(hào)多膚。
[0068] 實(shí)施例3CD34結(jié)合多膚與CD34陽(yáng)性細(xì)胞的CD34分子的結(jié)合
[0069] (1)準(zhǔn)備細(xì)胞：將K562細(xì)胞懸液置于37°C，5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá) 到80%時(shí)，離屯、棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗一次，離屯、，取細(xì)胞懸液，滴加在用多聚賴氨酸 包被的載玻片上，干燥后用冷丙酬固定10分鐘。
[0070] (2)PBS緩沖液清洗3次，每次5分鐘。然后用5% BSA封閉液室溫封閉1小時(shí)。 陽(yáng)07U 做一抗解育：CD34抗體（AR)的一抗稀釋液，滴加到玻片上，4°C解育過夜。PBS緩 沖液清洗3次，每次5分鐘。 陽(yáng)072] (4)二抗解育及多膚結(jié)合：分別將17號(hào)和19號(hào)多膚加入稀釋后的AlexaFluor 561標(biāo)記的抗兔抗體中混合，然后滴加到蓋玻片上，室溫避光解育1小時(shí)。PBS緩沖液清洗 3次，每次5分鐘。
[0073] 巧）1 μ g/mL的DAPI室溫避光染色5分鐘，PBS緩沖液清洗3次，每次5分鐘。
[0074] (6)用防巧光澤滅劑封片后，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。
[00巧]結(jié)果如圖3a-3b所不，圖中紅色欠光為CD34抗體柄;記的位置，綠色欠光為CD34結(jié) 合多膚（圖3a為17號(hào)多膚，圖3b為19號(hào)多膚）標(biāo)記的位置，藍(lán)色為DAPI細(xì)胞核染色，紅 色與綠色巧光相互重疊，證明了 17號(hào)、19號(hào)多膚與CD34分子結(jié)合。
[0076] 由本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，17號(hào)多膚、19號(hào)多膚可替代CD34抗體在分離或檢測(cè) CD34陽(yáng)性細(xì)胞中應(yīng)用，如在干細(xì)胞分離、白血病診斷或分型中應(yīng)用。同樣也可用于開發(fā)吸附 CD34陽(yáng)性細(xì)胞的