制備檸檬酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及發(fā)酵工程，尤其涉及一種制備檸檬酸的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 檸檬酸是目前為止采用生物化學(xué)方法生產(chǎn)的產(chǎn)量最大的有機(jī)酸，也是世界上應(yīng)用 最廣泛的有機(jī)酸。因其無(wú)毒、具有溫和爽快的酸味，水溶性好、酸味適度、易被吸收和價(jià)格低 廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，占食品酸味劑用量的60%以上。除了作為重要的食品 酸味劑用來(lái)改善食品風(fēng)味外，檸檬酸還兼有抑制微生物生長(zhǎng)、護(hù)色、改善黏度和流變性等作 用，而且在醫(yī)藥、飼料、化工、電子、紡織、石油、皮革、建筑、攝影、塑料、鑄造和陶瓷等工業(yè)領(lǐng) 域也都有十分廣闊的應(yīng)用。
[0003] 目前，全球檸檬酸的年產(chǎn)量約100~120萬(wàn)噸，檸檬酸的年總需求量為105~110 萬(wàn)噸，總體的供求狀況是供大于求的狀態(tài)。因此提高產(chǎn)酸率，降低檸檬酸生產(chǎn)成本來(lái)增強(qiáng)競(jìng) 爭(zhēng)力已刻不容緩。
[0004] 利用黑曲霉發(fā)酵是生產(chǎn)檸檬酸的主要方式，發(fā)酵過(guò)程代謝特性表明，氧的消耗速 率與產(chǎn)物的合成有著正比例相關(guān)性關(guān)系，而在發(fā)酵過(guò)程中，氧由發(fā)酵液向菌體內(nèi)的傳遞阻 力是氧限制的關(guān)鍵。
[0005] 相關(guān)技術(shù)中，檸檬酸生產(chǎn)存在的主要問(wèn)題是在種子培養(yǎng)階段存在著嚴(yán)重的孢子聚 集，這使得孢子形成的有效菌團(tuán)數(shù)明顯減少。孢子在靜電表面張力的作用下發(fā)生聚集，并發(fā) 芽交織在一起形成菌團(tuán)，降低了菌體與發(fā)酵液的接觸面積，阻礙了發(fā)酵過(guò)程中氧氣的傳遞， 大大降低了產(chǎn)物的合成速率。盡管通過(guò)增加孢子接種量的方法，但效果并沒(méi)有顯著改善。
[0006] 另外，在發(fā)酵培養(yǎng)階段，由于菌株好氧發(fā)酵過(guò)程中需氧量大，特別是發(fā)酵中后期， 短時(shí)間內(nèi)需氧量很高，而此時(shí)由于菌絲體及代謝產(chǎn)物不斷增多導(dǎo)致發(fā)酵液粘稠，細(xì)胞膜通 透性降低，不利于氧氣的傳遞，常規(guī)的依靠增大通風(fēng)量或不斷提高攪拌轉(zhuǎn)速等方式來(lái)提高 溶氧有時(shí)也不能滿足需要。無(wú)論是通風(fēng)量亦或是攪拌轉(zhuǎn)速都有上限，不能無(wú)限提高，況且開(kāi) 啟程度越大，發(fā)酵設(shè)備的損壞度以及能耗也越大，使得維修費(fèi)用和成本增加。另外，通氣量 過(guò)高或轉(zhuǎn)速過(guò)快，也容易對(duì)菌絲體造成機(jī)械損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。
[0008] 為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種可以提高檸檬酸的產(chǎn)量并且可以縮短發(fā)酵 時(shí)間的制備檸檬酸的方法。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制備檸檬酸的方法，包括以下步驟：
[0010] 步驟Si:種子培養(yǎng)階段
[0011] 1)種子培養(yǎng)基
[0012] 自來(lái)水與玉米粉按質(zhì)量比5 :2的比例混合，110°C保溫并不斷攪拌，并加入α -高 溫淀粉酶，恒溫30min，用碘指示劑檢驗(yàn)不變藍(lán)，即糖化完全，冷卻，回復(fù)原來(lái)體積，得到玉米 粉糖化液；
[0013] 將玉米粉糖化液經(jīng)兩層紗布過(guò)濾得糖化清液；
[0014] 用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到4. 5~5. 0,在搖瓶中加入玉米粉糖化液，紗布封口，121 °C滅菌 25min，得種子培養(yǎng)基；
[0015] 2)種子培養(yǎng)條件
[0016] 將黑曲霉（2330~2335)菌種按照接種量為5. OX IO5個(gè)孢子接種到種子培養(yǎng)基 中，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，在轉(zhuǎn)速160r/min、溫度34 ± I °C的條件下，進(jìn)行培養(yǎng)22h以得到種子 液；
[0017] 步驟S2 :發(fā)酵產(chǎn)酸階段
[0018] 1)發(fā)酵培養(yǎng)基
[0019] 將玉米粉糖化液與糖化清液按體積比1 :5的比例混合；在全自動(dòng)發(fā)酵罐中加入混 合后的培養(yǎng)基，添加0.3% (重量百分比）的（NH4)2SO4，調(diào)pH值到4. 5~5.0,115°C滅菌 25min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0020] 2)發(fā)酵條件
[0021] 將步驟Sl中得到的種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵以生成檸檬酸，發(fā)酵時(shí)， 在溫度為34 ± 1°C下通氣培養(yǎng)，采用液氨調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，使pH值維持在4. 4~4. 8,發(fā)酵 培養(yǎng)72小時(shí)后，發(fā)酵完畢；
[0022] 其中，所述種子培養(yǎng)基和所述發(fā)酵培養(yǎng)基中均包括通式（1)化合物中的至少一 種；
[0024] 所述通式⑴化合物中的RSC^C2。烷基，所述通式⑴化合物在所述種子培 養(yǎng)基和所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度均為〇. 15~7g/L。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制備梓檬酸的方法，種子培養(yǎng)基和所述發(fā)酵培養(yǎng)基中均包括 通式（1)化合物中的至少一種，通式（1)化合物在培養(yǎng)基中所起的作用，可以具有以下機(jī) 理：
[0026] 1、作為高效甲基供體，參與甲基化反應(yīng)以及能提高代謝途徑中關(guān)鍵酶的酶活，來(lái) 加快菌體生長(zhǎng)速率及代謝物產(chǎn)量。
[0027] 2、能提高細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧氣在胞內(nèi)外的交換，以及提高微生物 的呼吸鏈系統(tǒng)，顯著提高菌體的呼吸特性。
[0028] 3、作為滲透壓保護(hù)劑，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，更有利于胞內(nèi)產(chǎn)物向胞外的釋 放，解決由胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物濃度過(guò)高導(dǎo)致的反饋性抑制問(wèn)題。降低高滲透壓導(dǎo)致的呼吸抑制， 加快氧氣在細(xì)胞內(nèi)外的傳遞速率，降低能耗。
[0029] 4、作為表面活性劑，能夠很好地改善界面張力，降低孢子的聚集力，提高種子液中 菌球的分散度和菌體量。
[0030] 5、作為表面活性劑具有乳化劑的作用，更加快了氧氣在粘稠的發(fā)酵液中的傳遞速 度。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制備檸檬酸的方法，通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加通式（1)化合 物來(lái)提高檸檬酸產(chǎn)量，可以解決如下問(wèn)題：
[0032] 1、種子培養(yǎng)階段，在保證足夠菌體量的基礎(chǔ)上可以最大限度地增加菌團(tuán)與種子培 養(yǎng)基的接觸面積，也就意味著在發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)固定的情況下，最大限度地增加菌球的數(shù)量， 降低菌球的體積。
[0033] 2、發(fā)酵產(chǎn)酸階段，發(fā)酵過(guò)程中菌球的數(shù)量基本上是由種子培養(yǎng)過(guò)程中的菌球數(shù)量 決定的。通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加通式（1)化合物，能夠很好地改善界面張力，降低孢子的 聚集力，促進(jìn)了有效菌團(tuán)數(shù)量的快速增加，進(jìn)而在發(fā)酵罐中降低了菌團(tuán)的直徑，在保證同樣 菌體量的條件下促進(jìn)了比表面的大幅度增加，促進(jìn)了氧的傳遞速率和氧的消耗速率，檸檬 酸的合成速率顯著增加。
[0034] 可以有效解決由于發(fā)酵過(guò)程供氧不足及氧傳遞減弱導(dǎo)致的菌絲體呼吸抑制；可以 有效解決胞內(nèi)產(chǎn)物（酶制劑）向胞外的分泌出現(xiàn)不暢或不及時(shí)，而引起的胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物濃 度過(guò)高導(dǎo)致的反饋性抑制問(wèn)題。
[0035] 從而提高檸檬酸生產(chǎn)速率，縮短發(fā)酵時(shí)間，最終提高檸檬酸產(chǎn)量并降低能耗。
[0036] 另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的制備檸檬酸的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特 征：
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例，所述通式（1)化合物中的R為(；~C 12烷基。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例，所述通式（1)化合物為甜菜堿、月桂基甜菜堿、辛基甜菜 堿或異丙基甜菜堿。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例，所述通式（1)化合物為無(wú)水甜菜堿、一水甜菜堿、鹽酸鹽 甜菜堿或磷酸甜菜堿。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例，所述通式（1)化合物在所述種子培養(yǎng)基和所述發(fā)酵培養(yǎng) 基中的濃度均為〇. 5~5g/L。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例，所述通式（1)化合物在所述種子培養(yǎng)基中的濃度為 0. 6~lg/L，所述通式（1)化合物在所述發(fā)酵培養(yǎng)基的濃度為2g/L。
[0042] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的制備檸檬酸的方法發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同