或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0045] 首先需要說明的，根據本發(fā)明實施例的制備檸檬酸的方法，其所采用的種 子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)條件、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件均可以為現(xiàn)有的，可參考中國專利 CN104561140A。
[0046] 下面通過具體實施例來闡述根據本發(fā)明實施例的制備檸檬酸的方法。
[0047] 試驗菌種
[0048] 黑曲霉，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（編號：2330~2335)。
[0049] 種子培養(yǎng)基
[0050] 自來水與玉米粉按質量比5 :2的比例混合，110°C保溫并不斷攪拌，并加入α -高 溫淀粉酶，恒溫30min，用碘指示劑檢驗不變藍，即糖化完全，冷卻，回復原來體積，得到玉米 粉糖化液。
[0051 ] 將玉米粉糖化液經兩層紗布過濾得糖化清液。
[0052] 用鹽酸調節(jié)pH值到4. 5~5. 0,在搖瓶中加入玉米粉糖化液，紗布封口，121 °C滅菌 25min，得種子培養(yǎng)基。
[0053] 種子培養(yǎng)基設計4個梯度試驗，分別為在上述種子培養(yǎng)基基礎上不添加甜菜堿得 到1*種子培養(yǎng)基、添加〇. 6g/L的甜菜堿得到2*種子培養(yǎng)基、添加0. 8g/L的甜菜堿得到3* 種子培養(yǎng)基、添加 lg/L的甜菜堿得到4*種子培養(yǎng)基。
[0054] 培養(yǎng)條件
[0055] 將在土豆斜面培養(yǎng)基上生長成熟的黑曲霉，在無菌條件下，采用孢子懸浮液接種 法接種，對孢子進行計數(shù)，調整種子培養(yǎng)基中孢子接種量為5. 0X IO5個，將同等數(shù)量的孢子 分別接種到上述4個種子培養(yǎng)基中，置于旋轉式搖床上，160r/min，34± 1°C，培養(yǎng)22h。
[0056] 實驗結果
[0057] 甜菜堿添加量對種子培養(yǎng)基菌團形成率的影響
[0059] 由上表可以看出，在種子培養(yǎng)階段，隨著甜菜堿添加量的增加，總菌球數(shù)也增加。
[0060] 發(fā)酵培養(yǎng)基
[0061] 將玉米粉糖化液與過濾后的玉米糖化清液按體積比1 :5的比例混合。
[0062] 在全自動發(fā)酵罐中加入混合后的培養(yǎng)基，添加 0. 3% (重量百分比）的（NH4)2SO4, 調pH值到4. 5~5. 0。
[0063] 采用4個發(fā)酵罐，其中1#和3#發(fā)酵罐不添加甜菜堿，2#和4#發(fā)酵罐分別添加 2. Og/L的甜菜堿。115°C滅菌25min滅菌，得到4罐發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0064] 發(fā)酵條件
[0065] 將兩份等量的1*種子液分別轉接到1#和2#全自動發(fā)酵罐中，將兩份等量的4* 種子液分別轉接到3#和4#全自動發(fā)酵罐中。
[0066] 發(fā)酵開始時，分別在溫度為34±1°C下通氣培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，采用液氨調節(jié)培 養(yǎng)基的pH，使pH值維持在4. 4~4. 8。發(fā)酵培養(yǎng)72小時后，發(fā)酵完畢。
[0067] 發(fā)酵過程中，分別在36h，48h，60h，66h，72h檢測檸檬酸產量。采用0. 1429mol/L 的氫氧化鈉溶液滴定法測定檸檬酸。
[0068] 實驗結果如圖1所示。
[0069] 從圖1可以看出，只在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甜菜堿的2#罐的產酸率比對照1#罐提 尚約7. 0 %。
[0070] 只在種子培養(yǎng)基中添加甜菜堿的3#罐的產酸率比對照1號罐提高約3. 8%，同時 發(fā)酵周期72小時縮短到66小時。
[0071] 在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中同時添加甜菜堿的4#發(fā)酵罐比對照1#發(fā)酵罐，產 酸率提高約10. 8%，同時產物合成速率明顯提升，發(fā)酵周期從72小時縮短到60小時。
[0072] 在本說明書的描述中，參考術語"一個實施例"、"一些實施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特 點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不 必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任 一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技 術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結 合和組合。
[0073] 盡管上面已經示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例 性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在本發(fā)明的范圍內可以對上述 實施例進行變化、修改、替換和變型。
【主權項】
1. 一種制備巧樣酸的方法，其特征在于，包括W下步驟： 步驟S1:種子培養(yǎng)階段 1) 種子培養(yǎng)基 自來水與玉米粉按質量比5:2的比例混合，110°C保溫并不斷攬拌，并加入α-高溫淀 粉酶，恒溫30min，用艦指示劑檢驗不變藍，即糖化完全，冷卻，回復原來體積，得到玉米粉糖 化液； 將玉米粉糖化液經兩層紗布過濾得糖化清液； 用鹽酸調節(jié)抑值到4. 5~5.0,在搖瓶中加入玉米粉糖化液，紗布封口，121°C滅菌 25min，得種子培養(yǎng)基； 2) 種子培養(yǎng)條件 將黑曲霉（2330~2335)菌種按照接種量為5. 0X105個抱子接種到種子培養(yǎng)基中，置 于旋轉式搖床上，在轉速16化/min、溫度34+rC的條件下，進行培養(yǎng)22hW得到種子液； 步驟S2:發(fā)酵產酸階段 1) 發(fā)酵培養(yǎng)基 將玉米粉糖化液與糖化清液按體積比1 :5的比例混合；在全自動發(fā)酵罐中加入混合后 的培養(yǎng)基，添加0. 3% (重量百分比）的（畑4)25〇4,調抑值到4. 5~5. 0，115°C滅菌25min， 得到發(fā)酵培養(yǎng)基； 2) 發(fā)酵條件 將步驟S1中得到的種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵W生成巧樣酸，發(fā)酵時，在溫 度為34+rC下通氣培養(yǎng)，采用液氨調節(jié)培養(yǎng)基的抑，使抑值維持在4. 4~4.8,發(fā)酵培養(yǎng) 72小時后，發(fā)酵完畢； 其中，所述種子培養(yǎng)基和所述發(fā)酵培養(yǎng)基中均包括通式（1)化合物中的至少一種；(0 所述通式（1)化合物中的R為。~〇2。烷基，所述通式（1)化合物在所述種子培養(yǎng)基 和所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度均為0. 15~7g/L。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述通式（1)化合物中的R為C1~C12燒 基。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述通式（1)化合物為甜菜堿、月桂基甜 菜堿、辛基甜菜堿或異丙基甜菜堿。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述通式（1)化合物為無水甜菜堿、一水 甜菜堿、鹽酸鹽甜菜堿或憐酸甜菜堿。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述通式（1)化合物在所述種子培養(yǎng)基和 所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度均為0. 5~5g/L。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述通式（1)化合物在所述種子培養(yǎng)基中 的濃度為0.6~Ig/l，所述通式（1)化合物在所述發(fā)酵培養(yǎng)基的濃度為2g/L。
【專利摘要】根據本發(fā)明實施例的制備檸檬酸的方法，包括以下步驟：步驟S1：種子培養(yǎng)，將檸檬酸發(fā)酵菌種接種到種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)以得到種子液；步驟S2：發(fā)酵產酸，將步驟S1中得到的種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵以生成檸檬酸；其中，所述種子培養(yǎng)基和所述發(fā)酵培養(yǎng)基中均包括通式(1)化合物中的至少一種；所述通式(1)化合物中的R為C1～C20烷基。根據本發(fā)明實施例的制備檸檬酸的方法，種子培養(yǎng)基和所述發(fā)酵培養(yǎng)基中均包括通式(1)化合物中的至少一種，從而提高檸檬酸生產速率，縮短發(fā)酵時間，最終提高檸檬酸產量并降低能耗。
【IPC分類】C12P7/48, C12R1/685
【公開號】CN105400834
【申請?zhí)枴緾N201610009560
【發(fā)明人】馬興群, 劉雨, 宋琦, 毛秀立, 陳玉霞, 陳霞
【申請人】山東祥維斯生物科技股份有限公司
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2016年1月8日